銅脅迫下葡萄植株的生理響應和銅轉運蛋白基因VvCTR1的克隆及分析.pdf

南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 2018,41(2):256-265 http:/nauxb.njau.edu.cnJ o u r n a l o f N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y DOI:10.7685/jnau.201706002收 稿 日 期 :2017-06-03 基 金 項 目 : 國 家 自 然 科 學 基 金 項 目(31672131); 國 家 重 點 實 驗 室 開 放 課 題 項 目(ZW2014009); 中 國 博 士 后 特 別 資 助 項 目(2014T770533); 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 校 青 年 基 金 項 目(KJ2013013); 中 央 高 校 基 本 科 研 業(yè) 務 費 專 項 資 金(KJQN201541) 作 者 簡 介 : 劉 眾 杰, 博 士 研 究 生。 通 信 作 者: 房 經(jīng) 貴, 教 授, 研 究 方 向 為 葡 萄 遺 傳 育 種 學,E-mail:fangggnjau.edu.cn。 劉 眾 杰, 李 傲, 崔 夢 杰, 等. 銅 脅 迫 下 葡 萄 植 株 的 生 理 響 應 和 銅 轉 運 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 及 分 析J. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報,2018,41(2): 256-265. 銅 脅 迫 下 葡 萄 植 株 的 生 理 響 應 和 銅 轉 運 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 及 分 析 劉 眾 杰, 李 傲, 崔 夢 杰, 許 瀛 之, 上 官 凌 飛, 賈 海 鋒, 王 晨, 房 經(jīng) 貴 ( 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 園 藝 學 院, 江 蘇 南 京210095) 摘 要 : 目 的 本 文 旨 在 研 究 重 金 屬 銅 對 葡 萄 植 物 生 長 發(fā) 育 的 影 響, 為 揭 示 重 金 屬 銅 對 植 物 的 傷 害 機 制 提 供 理 論 依 據(jù)。 方 法 采 用 過 量 的 硫 酸 銅 以 及 硫 酸 銅 與 其 螯 合 劑 混 合 液 處 理 葡 萄 植 株 幼 苗, 以Hoagland 溶 液 為 對 照, 分 析 根 和 葉 片 的 發(fā) 育 情 況, 葉 綠 素 含 量 以 及 銅 在 植 株 中 的 分 布 情 況; 克 隆 了 銅 轉 運 蛋 白 基 因 V v C T R 1, 分 析 其 在 果 實 發(fā) 育 過 程 中 的 表 達 量, 并 對 其 結 構 特 征 和 物 種 間 的 同 源 性 進 行 分 析, 同 時 分 析 銅 脅 迫 下 葡 萄 根、 莖 和 葉 中 的 V v C T R 1 表 達 情 況。 結 果 與 對 照 相 比, 過 量 的 硫 酸 銅、 硫 酸 銅 與 檸 檬 酸 或EDTA 混 合 處 理 可 以 抑 制 葡 萄 植 株 新 根 的 發(fā) 育 數(shù) 量 和 長 度, 促 進 葉 片 葉 綠 素 的 降 解 和 落 葉 速 率, 增 加 葉 柄 基 部 乙 烯 的 產(chǎn) 生 以 及 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶 和 纖 維 素 酶 活 性, 尤 其 以 硫 酸 銅 和EDTA 混 合 處 理 傷 害 更 明 顯。 Cu 2+ 在 植 株 葉、 莖、 根 中 的 含 量 從 小 到 大 分 別 依 次 為 上 部 葉 片、 中 部 葉 片、 下 部 葉 片, 上 部 莖、 中 部 莖、 下 部 莖, 老 根、 幼 根; 硫 酸 銅 處 理 植 株 中 的Cu 2+ 含 量 高 于 對 照, 并 且 隨 著 處 理 時 間 的 延 長 含 量 不 斷 升 高, 尤 其 是 硫 酸 銅 與 檸 檬 酸 或 者EDTA 混 合 處 理 植 株 中Cu 2+ 含 量 更 高。 克 隆 的 銅 轉 運 蛋 白 基 因 V v C T R 1 中 無 內(nèi) 含 子, 其 編 碼 的 蛋 白 含 有3 個 跨 膜 區(qū)TMD13,N 端 含 有 1 個 甲 硫 氨 酸 富 含 區(qū)。 V v C T R 1 基 因 的 表 達 量 隨 著 果 實 發(fā) 育 逐 漸 降 低。 無 論 在 根 中 還 是 在 不 同 部 位 的 莖 和 葉 中, V v C T R 1 都 能 被 銅 誘 導。 結 論 過 量 的 銅 會 對 葡 萄 植 株 造 成 傷 害, 尤 其 與Cu 2+ 的 螯 合 劑 檸 檬 酸 或EDTA 同 時 存 在 時, 能 使 更 多 的Cu 2+ 進 入 植 物 體 內(nèi), 最 終 引 起 葡 萄 植 株 死 亡。 關 鍵 詞 : 銅; 葡 萄; 生 理 性 狀; 基 因 表 達 中 圖 分 類 號 :S663.1    文 獻 標 志 碼 :A    文 章 編 號 :1000-2030 (2018 )02-0256-10 Physiologicalresponsestocopperstressingrapeplantsandcloning andanalysisofcoppertransport V v C T R 1gene LIUZhongjie,LIAo,CUIMengjie,XUYingzhi,SHANGGUANLingfei,JIAHaifeng, WANGChen,FANGJinggui (CollegeofHorticulture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China) Abstract:ObjectivesThisstudyaimstoanalyzetheeffectsofheavymetalcopperonthegrowthanddevelopmentofgrapeplants, andprovidedtheoreticalbasisforrevealingthemechanismofdamagebyheavymetalcoppertoplants.MethodsTheexcessCuSO 4 andthemixtureofCuSO 4 anditschelatingagentwereappliedongrapeseedlings,therootandleafdevelopment,leafchlorophyll content,andthedistributionofcopperinplantswereanalyzed;coppertransport V v C T R 1genewasisolated,anditsexpressionlevels wereanalyzedduringfruitdevelopment. Itsstructureandhomologyamongspecieswereanalyzed,anditsexpressionlevelswere analyzedunderthecopperstressinroots,stemsandleaves.ResultsComparedtothecontrol,excessCuSO 4 ,themixtureofCuSO 4 andcitricacidorEDTAinhibitedthedevelopmentofthenumberandlengthofnewrootsingrape,promotedthedegradationof chlorophyllandleafratedrop,andincreasedtheproductionofethyleneandthepolygalacturonaseandcellulaseactivitiesinpetiole base.EspeciallytherewereobviousdamageinmixtureofCuSO 4 andEDTAtreatment.ThecontentofCu 2+ inleaves,stemsandroots fromsmalltolargewasthemorphologicallyuptodownofthestemsandleavesandoldrootstonewrootsinturn.Andthecontentof copperioninCuSO 4 treatedplantswashigherthancontrol,andshowedanincreasewiththeextensionoftime,especiallythemixture ofCuSO 4 andcitricacidorEDTAtreatmenthadmorecopperions;therewasnointronincoppertransport V v C T R 1gene,andit containedthreetransmembraneregionsofTMD1-3,whichNcontainedamethioninerichregion.Itsexpressiondecreasedgradually withthefruitdevelopment,andtheexpressionof V v C T R 1genewasenhancedundercopperbothinrootsandindifferentpositionsof stemsandleaves.ConclusionsExcessivecoppercancausedamagetograpeplants,especiallywhencombinedwithCu 2+ chelate  第2 期 劉 眾 杰, 等: 銅 脅 迫 下 葡 萄 植 株 的 生 理 響 應 和 銅 轉 運 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 及 分 析 citricacidorEDTA,whichcanmakemoreCu 2+ entertheplantandultimatelycausegrapeplantdeath. Keywords:opper;grape;physiologicalcharacter;geneexpression 近 年 來, 隨 著 化 肥 和 農(nóng) 藥 普 遍 施 用, 果 園 重 金 屬 污 染 日 益 嚴 重。 土 壤 中 的 重 金 屬 元 素 主 要 是 指 鎘、 汞、 銅、 鉛、 鉻、 鋅、 鎳 和 類 金 屬 元 素 砷 1 , 其 中 鋅 和 銅 還 是 植 物 的 必 需 元 素。 適 合 植 物 生 長 的 銅 含 量 范 圍 很 小,當 土 壤 中 的 有 效 銅 含 量 低 于5mgkg -1 時, 植 株 就 會 出 現(xiàn) 缺 素 癥, 高 于30mgkg -1 時 植 株 則 表 現(xiàn) 中 毒 癥 狀 2 。 由 于 含 銅 殺 菌 劑 的 使 用 以 及 工 業(yè) 上 含 銅 污 染 物 的 排 放, 果 園 中 銅 含 量 嚴 重 超 過 正 常 范 圍。 盧 樹 昌 等 3 研 究 結 果 表 明, 山 東 蘋 果 園 土 壤 銅 含 量 達44.8mgkg -1 。 當 重 金 屬 積 累 到 一 定 程 度 就 會 對 果 園 土 壤 造 成 污 染, 進 而 影 響 果 樹 的 生 長 發(fā) 育 和 果 品 質 量, 再 通 過 食 物 鏈 危 害 人 體 健 康。 因 此 銅 污 染 已 成 為 世 界 性 問 題。 葡 萄( V i t i s v i n i f e r a) 是 我 國 重 要 的 果 樹, 在 生 長 發(fā) 育 過 程 中 常 常 受 到 黑 痘 病、 霜 霉 病、 灰 霉 病、 炭 疽 病 和 白 腐 病 等 真 菌 性 病 害 的 影 響, 因 此 噴 施 藥 劑 是 葡 萄 園 管 理 不 可 缺 少 的 環(huán) 節(jié), 而 波 爾 多 液 是 使 用 頻 率 比 較 高 的 殺 菌 劑, 其 主 要 成 分 是 硫 酸 銅。 一 般 在 葡 萄 生 長 季 節(jié) 需 噴 波 爾 多 液36 次, 長 期 高 劑 量 噴 施 波 爾 多 液 會 造 成 土 壤 中 銅 的 積 累, 最 終 導 致 樹 體 中 重 金 屬 的 積 累 4 ; 法 國 部 分 葡 萄 園 土 壤 含 銅 量 高 達1280 mgkg -15 ; 天 津 郊 區(qū) 不 同 果 園 土 壤 中 含 銅 差 異 很 大, 最 高 的 葡 萄 園 銅 累 積 量 高 達216.7mgkg -16 。 銅 在 果 園 土 壤 中 比 非 果 園 土 壤 中 的 積 累 明 顯, 且 園 齡 越 大 土 壤 中 的 銅 積 累 越 多。 植 物 遭 受 銅 毒 害 時, 最 先 感 受 毒 害 的 器 官 是 根。 銅 被 根 系 吸 收 后 通 過 銅 轉 運 蛋 白 運 輸 至 植 物 的 其 他 器 官, 銅 在 不 同 器 官 的 積 累 規(guī) 律 由 大 到 小 依 次 為 根 系、 枝 干、 新 梢、 葉 片 7 。 銅 的 有 效 態(tài) 被 植 物 吸 收 后 大 部 分 富 集 于 根 部。 過 量 的 銅 會 導 致 膜 脂 過 氧 化、 堿 基 突 變、DNA 鏈 的 斷 裂、 蛋 白 質 的 損 傷, 導 致 植 物 代 謝 紊 亂, 甚 至 植 物 死 亡 8-9 。 研 究 表 明 高 濃 度 銅 脅 迫 下, 柑 橘 須 根 腐 爛, 根 干 質 量 顯 著 下 降, 根 中 的 銅 含 量 顯 著 升 高 10 ; 蘋 果 幼 樹 的 株 高、 根 長、 根 系 活 力、 葉 綠 素 含 量 及 各 部 位 干 質 量 等 顯 著 降 低 11 ; 蘋 果 花 粉 萌 發(fā) 及 花 粉 管 伸 長 12 、 歐 洲 越 橘 種 子 的 發(fā) 芽 等 受 到 抑 制 13 。 本 研 究 以 栽 培 品 種 夏 黑 幼 苗 為 研 究 對 象, 分 析 了 銅 在 植 株 中 的 積 累 和 植 株 的 生 理 及 分 子 變 化, 為 探 究 葡 萄 對 銅 脅 迫 的 應 答 以 及 果 樹 產(chǎn) 業(yè) 應 對 銅 污 染 提 供 依 據(jù)。 1 材 料 與 方 法 1.1 植 物 材 料 試 驗 材 料 為 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 實 驗 農(nóng) 場 的1 年 生 葡 萄 品 種 夏 黑, 其 生 長 于 營 養(yǎng) 土 與 蛭 石( 質 量 比 為11) 的 花 盆 中。 在 采 集 苗 木 前2 個 月, 每2 周 用Hoagland 植 物 營 養(yǎng) 液 進 行 澆 灌, 期 間 用 水 澆 灌1 次。 待 植 株 生 長 至0.5m 時, 用 硫 酸 銅 進 行 處 理。 1.2 試 驗 處 理 與 樣 品 采 集 試 驗 設 置4 個 處 理:1)1mmolL -1 CuSO 4 +1mmolL -1 人 工 螯 合 劑EDTA(CuSO 4 +EDTA);2)1mmolL -1 CuSO 4 +1mmolL -1 檸 檬 酸(CuSO 4 +CA);3) 單 施1mmolL -1 CuSO 4 (CuSO 4 );4)Hoagland 溶 液(CK)。 將 葡 萄 植 株 放 置 于 含 上 述 溶 液 的 玻 璃 杯 中, 并 在 溶 液 中 安 置 通 氣 裝 置 防 止 植 株 因 缺 少 氧 氣 而 快 速 致 死。 所 用 材 料 共3 種 取 樣 方 式:1) 葡 萄 植 株 在 上 述 溶 液 中 分 別 放 置2、4 和6d, 分 別 取 植 株 的 上 部、 中 部 和 下 部 葉 片, 上 部、 中 部 和 下 部 莖 段, 幼 根 和 老 根, 用 去 離 子 水 洗 滌2 次, 烘 干 至 恒 質 量。 稱 取0.5g 樣 品 于 液 氮 中 研 磨,然 后 用1mL 水 溶 解 至 勻 漿。2) 植 株 在 不 同 的 溶 液 中 生 長6d, 取 出 植 株, 統(tǒng) 計 新 根 數(shù) 量, 測 量 新 根 長 度, 計 算 平 均 值。 重 復3 次。3) 植 株 在 不 同 的 溶 液 中 生 長12d, 期 間 每 隔2d 統(tǒng) 計 葉 片 數(shù) 量, 測 定 葉 片 葉 綠 素 含 量, 并 取12d 時 脫 落 葉 片 葉 柄 底 端, 測 定 乙 烯 含 量。 對 于 果 實 樣 品 的 采 集, 采 用5 年 生 夏 黑 葡 萄, 分 別 在 花 后2、4、6、8( 轉 色 期)、10、12、14 周( 成 熟 期) 采 集 果 實, 去 掉 果 皮 后 液 氮 中 速 凍, 放 置-80 保 存 備 用。 1.3 指 標 測 定 銅 含 量 的 測 定 參 照 潘 逸 等 14 的 方 法。 總 葉 綠 素 的 含 量 測 定: 稱 取0.2g 葉 片, 用80%( 體 積 分 數(shù)) 丙 酮 研 磨, 然 后 用 濾 紙 過 濾、 洗 滌, 定 容 至25mL, 立 即 在645 和663nm 波 長 下 測 定 吸 光 值 15 。 葉 綠 素 總 含 量=(8.04 A 663 +20 .29 A 645 ) V / W1000。 式 中: V 為 提 取 液 的 體 積(mL); W 為 葉 片 的 質 量(g)。 乙 烯 含 量 的 測 定: 取 葉 柄 基 部 離 層 組 織 放 入 密 閉 盒 子 內(nèi),1h 后 利 用 氣 相 色 譜 法 測 定 乙 烯 含 量 16 。 樣 品 中 乙 烯 含 量(LL -1 )= 樣 品 峰 高 標 樣 濃 度/ 標 準 峰 高。 樣 品 乙 烯 生 成 速 率(Lg -1 h -1 )= 乙 烯 含 量 7 5 2 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第41 卷 (LL -1 ) 容 器 體 積(L)/ 密 封 時 間(h) 樣 品 質 量(g)。 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶(PG) 和 纖 維 素 酶 活 性 的 測 定 參 照Sun 等 16 的 方 法。 重 復3 次。 1.4 RNA 的 提 取 純 化 與cDNA 合 成 總RNA 的 提 取 和 消 化 參 照 賈 海 鋒 等 17 的 方 法。 PowerScript TM 反 轉 錄 酶 購 自Clontech 公 司, DNase 酶、 T aq 酶、dNTPs、DNAMarker, 熒 光 定 量 染 料SYBRGreen 均 購 自TaKaRa 公 司。 所 用 引 物 由 上 海 英 駿 生 物 技 術 有 限 公 司 合 成。 1.5 生 物 信 息 學 分 析 利 用MEGA5 軟 件 將 葡 萄VvCTR1 與 其 他11 個 物 種 的CTR 蛋 白 序 列 進 行 分 析 并 構 建 進 化 樹。 1.6 RT-qPCR 利 用 軟 件PrimerPremier5.0 設 計 熒 光 引 物。 以 葡 萄 中 的 A c t i n 基 因 為 內(nèi) 參 基 因, 根 據(jù) 葡 萄 中 銅 轉 運 蛋 白 序 列 設 計 熒 光 定 量qPCR 引 物( 表1)。 按 照SYBR P r e m i x E x T aq TM 試 劑 盒( 寶 生 物 工 程 有 限 公 司) 操 作 指 導, 采 用 實 時 熒 光 定 量PCR(RT-qPCR) 的 方 法, 檢 測 基 因 的 稀 釋 相 對 表 達 量。 對 反 轉 錄 所 得 的cDNA 分 別 進 行5 個 梯 度(1、10 -1 、10 -2 、10 -3 和10 -4 ) 稀 釋, 實 施 熒 光 定 量 反 應, 然 后 繪 制 相 對 標 準 曲 線。 相 關 基 因 和 A c t i n 基 因RT-qPCR 擴 增 的 總 反 應 體 系 為20L, 包 括:10LSYBR P r e m i x E x T aq TM 混 合 液,2L cDNA,0.4L 上 游 引 物(10molL -1 ),0.4L 下 游 引 物(10molL -1 ),7.2L 無 核 酸 污 染 的 滅 菌 水。 反 應 程 序 為:942min;9420s,5530s,7230s,40 個 循 環(huán), 每 次 循 環(huán) 第3 步 進 行 熒 光 采 集, 最 后 從 60 升 溫 至95 即 每 隔30s 上 升0.5, 總 共71 個 循 環(huán), 檢 測 其 熒 光 值, 并 繪 制 熔 點 曲 線, 標 準 品cDNA 和 待 測 樣 品 均 重 復3 次。 采 用2 - C T 法 進 行 數(shù) 據(jù) 處 理。 表1 引 物 序 列 及PCR 擴 增 片 段 大 小 Table1 SequenceofprimersandsizesofPCRamplifiedproducts 基 因 Gene 引 物 序 列 Sequenceofprimer 片 段 大 小/bp Fragmentsize 登 錄 號 Accessionnumber 用 途Usage V v C T R 1 5-CCTATTCAAACTCCGACGC-3 5-TCCACCACCTCTTCCTGAT-3 206 NM 001281256 qPCR A c t i n 5-GGATTCTGGTGATGGTGTG-3 5-CAGCAAGGTCAAGACGAA-3 150 XM 002273532 qPCR V v A C O 1 5-CTTGTTTCCAGGTTGTGTC-3 5-TGTGTGAGGAGAGACTAACT-3 121 NM 001280942 qPCR V v C T R 1 5-ATGATGCACATGACTCTGTAC-3 5-TCAGGAACAGGCACACGAGT-3 446 全 長Full-length V v C T R 1 5-TCTTCTCCGTCTTCTACCA-3 5-ATCTCAGGAACAGGCACA-3 343 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 2 5-ATGTATGCTCTCGCCTTG-3 5-CTAACCAAACACACCATCAC-3 321 HQ108186 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 3 5-ATGTCTCAGCATGGTGGCAT-3 5-AGGTGCCACAGAGAGTGCAC-3 391 HQ108187 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 4 5-ATCAGCCTCTTCCCAGAA-3 5-GGACATCAAAGCCAGCAT-3 380 HQ108188 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 5 5-GAGTGGCTTTCCTATTGCC-3 5-ATTTCCGTCCTTACACAGAC-3 368 HQ108189 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 6 5-AACATCCACCACCACAAG-3 5-CAGCAACTCATAGAAGGAAG-3 415 HQ108190 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 7 5-ATGGTGCCAATGAACAGCAC-3 5-TCAGAGGCTTTCTCATAAGG-3 500 HQ108191 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 8 5-ATGACCTTCTACTGGAGCA-3 5-AAGCAGAGAGAGAGAGAGG-3 456 HQ108192 半 定 量 Semi-quantitative 1.7 數(shù) 據(jù) 分 析 采 用SPSS18.0 軟 件 進 行 單 因 素 方 差 分 析,Duncans 法 進 行 多 重 比 較。 數(shù) 據(jù) 均 以 x SE 表 示。 2 結 果 與 分 析 2.1 銅 脅 迫 對 葡 萄 植 株 中 銅 離 子 積 累 的 影 響 由 表2 可 見: 隨 著 處 理 時 間 的 延 長, 銅 脅 迫 后 葡 萄 植 株 各 部 位 銅 含 量 明 顯 升 高。 幼 嫩 根 中 積 累 的 銅 離 8 5 2  第2 期 劉 眾 杰, 等: 銅 脅 迫 下 葡 萄 植 株 的 生 理 響 應 和 銅 轉 運 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 及 分 析 子 多 于 老 根, 而 且 植 株 各 部 位 中 的 銅 離 子 積 累 量 由 下 到 上 逐 漸 減 少, 由 小 到 大 依 次 為 上 部 葉 片、 中 部 葉 片、 下 部 葉 片, 上 部 莖、 中 部 莖、 下 部 莖, 老 根、 幼 根。 表2 葡 萄 植 株 各 部 位 的 銅 含 量 Table2 Coppercontentindifferentpartsofgrapeplant mg g -1 處 理 Treatment 處 理 時 間/d Treatmenttime 上 部 葉 片 Upleaf 中 部 葉 片 Middleleaf 下 部 葉 片 Lowleaf 上 部 莖 Upstem 中 部 莖 Middlestem 下 部 莖 Lowstem 幼 根 Newroot 老 根 Oldroot 2 0.250.08 d 0.410.15 d 0.490.10 d 0.190.03 c 0.270.05 d 0.330.07 d 0.890.09 d 0.670.13 d CK 4 0.290.05 d 0.430.03 d 0.650.06 d 0.120.04 d 0.210.09 d 0.320.08 d 1.210.22 d 0.920.15 d 6 0.360.06 d 0.450.08 d 0.690.11 d 0.290.06 d 0.230.08 d 0.500.11 d 1.520.33 d 1.630.62 d 2 0.490.14 c 0.880.17 bc 1.030.22 bc 0.290.08 bc 0.390.07 c 0.770.16 c 1.790.27 c 1.550.32 c CuSO 4 4 0.680.11 ab 1.060.27 b 1.380.34 b 0.420.08 b 0.880.13 ab 1.470.14 b 3.270.45 b 4.270.27 b 6 0.870.08 a 2.190.52 a 2.530.17 a 0.870.09 a 1.160.21 a 2.230.37 a 5.460.55 a 5.730.47 a 2 0.600.04 c 1.370.15 c 7.410.87 c 0.530.21 bc 2.250.33 c 5.980.45 c 2.840.52 c 3.880.66 c CuSO 4 +CA 4 1.800.12 ab 2.600.53 ab 9.690.67 ab 0.700.20 b 4.530.66 b 10.760.52 b 5.370.87 b 8.760.82 b 6 2.360.64 a 3.030.43 a 11.891.22 a 1.290.24 a 7.370.88 a 17.901.86 a 8.540.93 a 11.570.82 a 2 0.630.07 c 1.530.09 c 10.670.82 bc 0.470.11 c 1.230.23 c 2.340.53 c 6.540.77 bc 8.470.53 bc CuSO 4 +EDTA 4 1.420.37 b 3.210.54 b 13.981.38 b 4.700.37 ab 3.100.15 b 10.000.78 b 7.540.85 b 9.541.21 b 6 3.620.24 a 4.260.32 a 21.812.38 a 5.501.08 a 9.681.60 a 23.262.61 a 14.701.83 a 13.721.52 a注:1)CK: 對 照;CuSO 4 :1mmolL -1 CuSO 4 ;CuSO 4 +CA:1mmolL -1 CuSO 4 +1mmolL -1 CA( 檸 檬 酸);CuSO 4 +EDTA:1mmolL -1 CuSO 4 + 1mmolL -1 EDTA。 2) 不 同 字 母 表 示 處 理 間 差 異 顯 著( P0.05)。 下 同。 Note:1)CK:Control;CuSO 4 :1mmolL -1 CuSO 4 ;CuSO 4 +CA:1mmolL -1 CuSO 4 +1mmolL -1 CA(citricacid);CuSO 4 +EDTA:1mmolL -1 CuSO 4 +1mmolL -1 EDTA. 2)Differentlettersindicatesignificantdifferenceat0.05levelamongdifferenttreatments.Thesameasfollows. 2.2 銅 脅 迫 對 葡 萄 根 生 長 發(fā) 育 的 影 響 由 圖1 可 見: 對 照 植 株 在Hoagland 營 養(yǎng) 液 中 已 經(jīng) 開 始 有 新 根 生 出, 數(shù) 量 為38 條, 根 長19cm 左 右, 顯 著 高 于3 種 銅 脅 迫 處 理。 根 生 長 狀 態(tài) 最 好 的 是 單 施CuSO 4 處 理, 新 生 根 數(shù) 為19 條, 顯 著 高 于CuSO 4 + EDTA 和CuSO 4 +CA 處 理; 單 施CuSO 4 處 理 根 的 平 均 長 度11cm 左 右, 顯 著 高 于CuSO 4 +EDTA 處 理, 但 與 CuSO 4 +CA 處 理 差 異 不 顯 著。 圖1 銅 脅 迫 對 葡 萄 植 株 根 生 長 的 影 響 Fig1 Effectsofcopperstressongraperootgrowth 2.3 銅 脅 迫 對 葡 萄 葉 片 生 長 發(fā) 育 的 影 響 從 圖2 可 見: 銅 脅 迫 使 幼 苗 葉 片 從 下 部 到 上 部 開 始 脫 落, 其 中CuSO 4 +EDTA 處 理 的 葡 萄 幼 苗 生 長 狀 態(tài) 最 差, 單 施CuSO 4 和CuSO 4 +CA 處 理 的 葉 片 脫 落 趨 勢 相 似。 在 銅 脅 迫6d 時, 單 施CuSO 4 和CuSO 4 +CA 處 理 的 幼 苗, 植 株 底 端 的 葉 片 已 有 脫 落, 但 是 中 上 部 的 葉 片 長 勢 良 好; 而CuSO 4 +EDTA 處 理 植 株 底 端 和 中 9 5 2 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第41 卷 部 的 葉 片 都 已 經(jīng) 脫 落, 只 有 最 上 部 的 幼 嫩 葉 片 未 脫 落。 銅 脅 迫12d 后,3 種 處 理 的 剩 余 葉 片 量 都 已 低 于 20%, 其 中CuSO 4 +EDTA 處 理 的 葡 萄 幼 苗 葉 片 在12d 時 已 全 部 脫 落。 圖2 銅 脅 迫 對 葡 萄 葉 片 生 長 的 影 響 Fig2 Effectsofcopperstressongrapeleafgrowth 由 圖3 可 見: 銅 處 理 葡 萄 植 株12d 后 會 使 葉 片 黃 化。 單 獨CuSO 4 處 理 的 植 株 脫 落 的 葉 片 還 帶 青 色; 而CuSO 4 +CA 處 理 的 植 株 其 脫 落 的 葉 片 呈 黃 色;CuSO 4 +EDTA 處 理 的 植 株 其 脫 落 的 葉 片 已 經(jīng) 干 枯。 表 明 銅 處 理 后 的 植 株 葉 綠 素 降 解 嚴 重。 圖3 銅 脅 迫 對 葡 萄 植 株 葉 綠 素 含 量 的 影 響 Fig3 Effectsofcopperstressongrapeleafchlorophyllcontent 從 圖4 可 以 看 出: 對 照 植 株 葉 柄 底 端 的 乙 烯 含 量 為0.23LL -1 , 而CuSO 4 處 理 乙 烯 含 量 升 高 了 十 幾 倍, 尤 其 是CuSO 4 +EDTA 處 理 乙 烯 含 量 達 到 了3.25LL -1 。 同 時, 乙 烯 合 成 路 徑 中 的 V v A C O 1 基 因 的 表 達 量 也 在 銅 脅 迫 下 升 高, 說 明 銅 脅 迫 誘 導 了 葉 柄 底 端 乙 烯 的 產(chǎn) 生。 而 且 乙 烯 含 量 的 上 升 也 使 得 多 聚 半 乳 0 6 2  第2 期 劉 眾 杰, 等: 銅 脅 迫 下 葡 萄 植 株 的 生 理 響 應 和 銅 轉 運 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 及 分 析 糖 醛 酸 酶(PG) 和 細 胞 纖 維 素 酶 活 性 升 高, 并 顯 著 高 于 對 照。 這 些 生 理 現(xiàn) 象 的 變 化 導 致 了 葉 柄 底 端 離 層 的 產(chǎn) 生, 最 后 導 致 葉 片 脫 落。 圖4 銅 脅 迫 對 葡 萄 葉 柄 基 部 乙 烯 和 細 胞 壁 酶 活 性 的 影 響 Fig4 Effectsofcopperstressonethylenecontentandcellwallenzymeactivityofthegrapeleafpetiolebase 圖5 銅 轉 運 蛋 白 基 因 的 克 隆 及 表 達 量 Fig5 Coppertransportgenecloneandexpressionlevels 2.4 銅 轉 運 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 表 達 和 生 物 信 息 學 分 析 由 圖5 可 見: 從 植 株 的 幼 嫩 葉 片 中 擴 增 了 V v C T R 1 基 因, 全 長 為447bp, 編 碼149 個 氨 基 酸 序 列。 同 時 提 取 了 幼 嫩 葉 片 的DNA 進 行 了 V v C T R 1 基 因 的 擴 增, 與mRNA 擴 增 的 序 列 相 比, 發(fā) 現(xiàn) V v C T R 1 基 因 沒 有 內(nèi) 含 子 序 列, 這 說 明 V v C T R 1 基 因 對 銅 脅 迫 可 快 速 應 答。 V v C T R 1 基 因 在 果 實 發(fā) 育 成 熟 過 程 前 期 表 達 量 很 1 6 2 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第41 卷 高, 在 果 實 成 熟 后 開 始 有 些 下 降。 同 時 對 葡 萄 中 的 其 他 銅 轉 運 蛋 白 基 因 的 表 達 量 也 進 行 了 分 析, V v C T R 8 基 因 在 果 實 發(fā) 育 前 期 表 達 量 很 高, 但 是 在 第8 周 的 轉 色 期 開 始 下 降 直 至 成 熟; V v C T R 2、 V v C T R 3、 V v C T R 4、 V v C T R 5、 V v C T R 6、 V v C T R 7 等 基 因 在 果 實 發(fā) 育 過 程 中 的 表 達 量 均 比 較 低, 而 且 沒 有 發(fā) 生 劇 烈 的 變 化。 在 8 個 銅 轉 運 蛋 白 基 因 中, 只 有 V v C T R 1 受 銅 處 理 的 強 烈 誘 導, 因 此 選 擇 V v C T R 1 做