持續(xù)多代芽變選種及其與雜交育種聯(lián)合對蘋果紅色性狀持續(xù)改良的方法 [發(fā)明].pdf

19 中華人民共和國 國家知識產(chǎn)權局 12 發(fā)明專利申請 10 申請公布號 43 申請公布日 21 申請?zhí)?201710092300 0 22 申請日 2017 02 21 83 生物保藏信息 CGMCC NO 13783 2017 02 17 CGMCC NO 12468 2016 12 08 71 申請人 山東農(nóng)業(yè)大 學 地址 271018 山東省泰安市岱宗大街61號 72 發(fā)明人 陳學森 姜 生輝 毛志泉 姜遠茂 王志剛 張宗營 王楠 徐海峰 王意 程 74 專利代理機構 北京 紀凱知識產(chǎn)權代理有限 公司 1 1245 代理人 關暢 何葉喧 51 Int Cl A01H 1 02 2006 01 A01H 1 04 2006 01 A01G 17 00 2006 01 54 發(fā)明名稱 持續(xù)多代芽變選種及其與雜交育種聯(lián)合對 蘋果紅色 性狀持續(xù)改良的方法 57 摘要 本發(fā)明公開了一種持續(xù)多代芽變選種及其 與雜交育種聯(lián)合對蘋果紅色性狀持續(xù)改良的方 法 本發(fā)明提供的方法包括如下步驟 將蘋果品 種C0進行 持續(xù)多代的芽變選種 第一代芽變選種 將蘋果品種CO作為出發(fā) 品種 以后的每代芽變選 種均將上一代芽變選種得到的品種作為出發(fā)品 種 每代芽變選種從滿足如下性狀的芽發(fā)育出的 枝條或植株中選擇目標品種 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育 成的枝條或植株 上生長的蘋果的果 皮 的花青苷含量為出 發(fā) 品種的2倍以上 c 芽發(fā)育 成的枝條或植株 上生長的蘋果的果皮的特異DNA 分子的甲基化水平為出發(fā)品種的二分之一以下 本發(fā)明對蘋果紅色性狀的持續(xù)改良具有重要意 義 權利要求書2頁 說明書12頁 序列表1頁 附圖4頁 CN 106613921 A 2017 05 10 CN 106613921 A 1 一種蘋果育種方法 包括如下步驟 將蘋果品種C0進行持續(xù)多代的芽變選種 第一代 芽變選種將蘋果品種CO作為出發(fā)品種 以后的每代芽變選種均將上一代芽變選種得到的品 種作為出發(fā)品種 每代芽變選種從全滿足如下三個性狀的芽發(fā)育出的枝條或植株中選擇目 標品種 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的花青苷含量 為出發(fā)品種的2倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的特異DNA分子的 甲基化水平為出發(fā)品種的二分之一以下 所述特異DNA分子為如下 或 或 序列表的序列1所示的DNA分子 將序列表的序列1所示的DNA分子進行一個或幾個核苷酸的插入和 或缺失和 或 替換得到的DNA分子 與序列表的序列1所示的DNA分子具有90 以上同源性的DNA分子 2 如權利要求1所述的蘋果育種方法 其特征在于 所述育種方法得到的蘋果品種滿足 如下指標 a 和 或 b a 著色速度大于蘋果品種C0 b 著色指數(shù)大于蘋果品種C0 3 一種蘋果育種方法 包括如下步驟 將蘋果品種C0進行持續(xù)多代的芽變選種 第一代 芽變選種將蘋果品種CO作為出發(fā)品種 以后的每代芽變選種均將上一代芽變選種得到的品 種作為出發(fā)品種 每代芽變選種從全滿足如下四個性狀的芽發(fā)育出的枝條或植株中選擇目 標品種 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的花青苷含量 為出發(fā)品種的2倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的特異DNA分子的 甲基化水平為出發(fā)品種的二分之一以下 d 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長枝條的節(jié)間長 度為2cm以下 所述特異DNA分子為如下 或 或 序列表的序列1所示的DNA分子 將序列表的序列1所示的DNA分子進行一個或幾個核苷酸的插入和 或缺失和 或 替換得到的DNA分子 與序列表的序列1所示的DNA分子具有90 以上同源性的DNA分子 4 如權利要求3所述的蘋果育種方法 其特征在于 所述育種方法得到的蘋果品種滿足 如下指標 a 和 或 b 和 或 c a 著色速度大于蘋果品種C0 b 著色指數(shù)大于蘋果品種 C0 c 枝條的節(jié)間長度為2cm以下 5 一種蘋果育種方法 包括如下步驟 1 將蘋果品種A和蘋果品種B進行雜交 獲得雜交種子 所述蘋果品種A為蘋果 Malus domestica CSR6R6 666 蘋果 Malus domestica CSR6R6 666 其保藏編號為CGMCC NO 13783 所述蘋果品種B為權利要求1至4中任一所述方法得到的蘋果品種 2 將步驟 1 得到的雜交種子播種并育苗 得到實生苗 3 將步驟 2 得到的實生苗移栽至大田 待其長出果實后不對果實進行套袋 篩選得 到目的植株 6 如權利要求5所述的方法 其特征在于 移栽第4年 在離地面20cm處對實生苗的主干 進行環(huán)剝 環(huán)剝寬度為0 5 1 0cm 深達木質(zhì)部 7 如權利要求5或6所述的方法 其特征在于 移栽第5年 在實生苗的盛花期進行如下 操作 每個花序的5朵花僅保留中心花 其他全部疏除 權 利 要 求 書 1 2 頁 2 CN 106613921 A 8 如權利要求5或6或7所述的方法 其特征在于 所述目的植株為果肉全紅的植株 9 如權利要求5或6或7所述的方法 其特征在于 所述目的植株為滿足如下 f1 和 或 f2 和 或 f3 和 或 f4 的蘋果植株 f1 果肉全紅 f2 果肉高類黃酮含量 f3 果肉高 花青苷含量 f4 果肉高抗氧化能力 10 蘋果 Malus domestica CSR6R6 666在蘋果育種中的應用 蘋果 Malus domestica CSR6R6 666 其保藏編號為CGMCC NO 13783 權 利 要 求 書 2 2 頁 3 CN 106613921 A 持續(xù)多代芽變選種及其與雜交育種聯(lián)合對蘋果紅色性狀持續(xù) 改良的方法 技術領域 0001 本發(fā)明涉及一種持續(xù)多代芽變選種及其與雜交育種聯(lián)合對蘋果紅色性狀持續(xù)改 良的方法 背景技術 0002 醫(yī)食同源 是發(fā)展方向 吃營養(yǎng) 吃健康 已成為人們的共識 蘋果果實含有較多 的人體容易吸收的游離多酚或類黃酮 在抗氧化 預防心腦血管疾病及抗腫瘤等方面均具 有較好的作用 一天一蘋果 醫(yī)生遠離我 世界上相當多的國家都將蘋果作為主要消費果 品而大力推薦 蘋果果實的紅皮和紅肉性狀主要由花青苷發(fā)育而來 是類黃酮的主要組分 為此 進一步選育花青苷 或類黃酮 含量高 外觀品質(zhì)好 保健價值大的蘋果新品種 對推 動蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展 改進人類健康具有重要意義 0003 果肉紅色 類黃酮含量高的功能型蘋果育種是多個品質(zhì)性狀 基因 的有效集成與 平衡 為完善新品種選育方案 提高育種效率 課題組采取了三項措施 一是在新疆紅肉蘋 果與蘋果品種雜種一代果實總酚含量等性狀遺傳變異研究的基礎上 提出并實施了 三選 兩早一促 的蘋果育種法 專利號ZL 2013 1 0205419 6 育種效率顯著提高 二是利用遺 傳背景復雜的 嘎啦 美國八號 寒富 及 富士 等蘋果品種與新疆紅肉蘋果 M sieversii f niedzwetzkyana 進行多親本雜交與反復回交 旨在進行品質(zhì)育種 目前 已構建回交一 二代分離群體40個 定植雜種實生苗4萬株 并申報了 果樹多種源品質(zhì)育種 法 專利申請?zhí)?015 10428448 8 及 易著色蘋果品種培育法 專利申請?zhí)?201510890141 X 2個育種技術發(fā)明專利 三是及時地以性狀基本穩(wěn)定的后代株系為試材 進行品質(zhì)性狀評價及發(fā)育機理的研究 并已取得了諸多重要進展 目前 已創(chuàng)建了常規(guī)雜交 與生物技術有機結合的蘋果高效育種技術體系 創(chuàng)制了一批新品種及優(yōu)異種質(zhì) 研發(fā)了蘋 果新品種配套高效栽培技術體系 授權和申報發(fā)明專利10余項 育成新品種 系 16個 發(fā)表 相關研究論文120篇 其中SCI論文20余篇 這些研究成果總體處在國際同類研究的領先水 平 發(fā)明內(nèi)容 0004 本發(fā)明的目的是提供一種持續(xù)多代芽變選種及其與雜交育種聯(lián)合對蘋果紅色性 狀持續(xù)改良的方法 0005 本發(fā)明首先保護一種蘋果育種方法 方法甲 包括如下步驟 將蘋果品種C0進行 持續(xù)多代的芽變選種 第一代芽變選種將蘋果品種CO作為出發(fā)品種 以后的每代芽變選種 均將上一代芽變選種得到的品種作為出發(fā)品種 每代芽變選種從全滿足如下三個性狀的芽 發(fā)育出的枝條或植株中選擇目標品種 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生 長的蘋果的果皮的花青苷含量為出發(fā)品種的2倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的 蘋果的果皮的特異DNA分子的甲基化水平為出發(fā)品種的二分之一以下 說 明 書 1 12 頁 4 CN 106613921 A 0006 所述特異DNA分子為如下 或 或 0007 序列表的序列1所示的DNA分子 0008 將序列表的序列1所示的DNA分子進行一個或幾個核苷酸的插入和 或缺失 和 或替換得到的DNA分子 0009 與序列表的序列1所示的DNA分子具有90 以上同源性的DNA分子 0010 所述多代為2代以上 可為 3代 4代 5代 6代等 0011 所述育種方法得到的蘋果品種滿足如下指標 d1 和 或 d2 d1 著色速度大于 蘋果品種C0 d2 著色指數(shù)大于蘋果品種C0 0012 所述育種方法得到的蘋果品種滿足如下指標 d3 和 或 d4 d3 著色速度為 除 袋之后5天以內(nèi)著色 d4 著色指數(shù)為80 以上 0013 所述育種方法得到的蘋果品種滿足如下指標 d5 和 或 d6 d5 著色速度為 除 袋之后4天以內(nèi)著色 d6 成熟果實表皮80 以上為寶石紅色 0014 所述育種方法得到的蘋果品種滿足如下指標 d7 和 或 d8 d7 著色速度為 除 袋之后5天以內(nèi)著色 d8 著色指數(shù)為90 以上 0015 所述育種方法得到的蘋果品種滿足如下指標 d9 和 或 d10 d9 著色速度為 除袋之后4天以內(nèi)著色 d20 成熟果實表皮90 以上為寶石紅色 0016 所述蘋果品種C0具體可為 紅富士 蘋果或 嘎啦 蘋果 0017 本發(fā)明還保護一種蘋果育種方法 方法乙 包括如下步驟 將蘋果品種C0進行持 續(xù)多代的芽變選種 第一代芽變選種將蘋果品種CO作為出發(fā)品種 以后的每代芽變選種均 將上一代芽變選種得到的品種作為出發(fā)品種 每代芽變選種從全滿足如下四個性狀的芽發(fā) 育出的枝條或植株中選擇目標品種 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長 的蘋果的果皮的花青苷含量為出發(fā)品種的2倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋 果的果皮的特異DNA分子的甲基化水平為出發(fā)品種的二分之一以下 d 芽發(fā)育成的枝條或 植株上生長枝條的節(jié)間長度為2cm以下 0018 所述特異DNA分子為如下 或 或 0019 序列表的序列1所示的DNA分子 0020 將序列表的序列1所示的DNA分子進行一個或幾個核苷酸的插入和 或缺失 和 或替換得到的DNA分子 0021 與序列表的序列1所示的DNA分子具有90 以上同源性的DNA分子 0022 所述多代為2代以上 可為 3代 4代 5代 6代等 0023 所述育種方法得到的蘋果品種滿足如下指標 e1 和 或 e2 和 或 e3 e1 著色 速度大于蘋果品種C0 e2 著色指數(shù)大于蘋果品種C0 e3 枝條的節(jié)間長度為2cm以下 0024 所述育種方法得到的蘋果品種滿足如下指標 e4 和 或 e5 和 或 e6 e4 著色 速度為 除袋之后5天以內(nèi)著色 e5 著色指數(shù)為80 以上 e6 枝條的節(jié)間長度為2cm以 下 0025 所述育種方法得到的蘋果品種滿足如下指標 e7 和 或 e8 和 或 e9 e7 著色 速度為 除袋之后5天以內(nèi)著色 e8 成熟果實表皮80 以上為濃紅色 e9 枝條的節(jié)間長 度為2cm以下 0026 所述育種方法得到的蘋果品種滿足如下指標 e10 和 或 e11 和 或 e12 e10 說 明 書 2 12 頁 5 CN 106613921 A 著色速度為 除袋之后5天以內(nèi)著色 e11 著色指數(shù)為90 以上 e12 枝條的節(jié)間長度為 2cm以下 0027 所述育種方法得到的蘋果品種滿足如下指標 e13 和 或 e14 和 或 e15 e13 著色速度為 除袋之后5天以內(nèi)著色 e14 成熟果實表皮90 以上為濃紅色 e15 枝條的 節(jié)間長度為2cm以下 0028 所述蘋果品種C0具體可為 紅富士 蘋果或 嘎啦 蘋果 0029 本發(fā)明還保護一種蘋果育種方法 方法丙 包括如下步驟 0030 1 將蘋果品種A和蘋果品種B進行雜交 獲得雜交種子 所述蘋果品種A為蘋果 Malus domestica CSR6R6 666 所述蘋果品種B為以上任一所述方法得到的蘋果品種 0031 2 將步驟 1 得到的雜交種子播種并育苗 得到實生苗 0032 3 將步驟 2 得到的實生苗移栽至大田 待其長出果實后不對果實進行套袋 篩 選得到目的植株 0033 所述將蘋果品種A和蘋果品種B進行雜交的方法如下 取蘋果品種A的花粉 對去雄 后的蘋果品種B進行授粉 0034 所述步驟 2 中 進行所述播種前 先將所述雜交種子進行1 3 層積處理以打破 休眠 所述層積處理的時間具體可為60天 0035 所述步驟 2 中 進行所述育苗的條件為 25 每天光照12小時 光照強度 3000lx 從種子萌發(fā)開始每7 10天澆一次營養(yǎng)液 0036 所述步驟 2 中 進行所述育苗的條件具體為 將所述雜交種子播種于裝有育苗基 質(zhì)的營養(yǎng)缽 每個營養(yǎng)缽播種3 5粒種子 培養(yǎng)至實生苗高度為8 15cm且根頸處木質(zhì)化 通 常為播種2 3個月 然后將實生苗移栽至新的裝有育苗基質(zhì)的營養(yǎng)缽 每個營養(yǎng)缽移栽1 株 進行培養(yǎng) 所述培養(yǎng)的條件為 25 每天光照12小時 光照強度3000lx 從種子萌發(fā)開 始每7 10天澆一次營養(yǎng)液 將MS基本培養(yǎng)基的大量元素母液用水稀釋至10倍體積即為營養(yǎng) 液 每次每個營養(yǎng)缽澆40 50ml 0037 所述步驟 3 中 在所述大田中進行栽培管理的方法如下 在擬定植實生苗的大田 中每畝施入有機肥6000kg并澆水沉實 定植實生苗后在大田中每畝再施入有機肥6000kg并 及時澆水 所述有機肥具體可為充分腐熟的奶牛糞 0038 所述方法中 移栽第4年 在離地面20cm處對實生苗的主干進行環(huán)剝 環(huán)剝寬度為 0 5 1 0cm 深達木質(zhì)部 0039 所述方法中 移栽第5年 在實生苗的盛花期進行如下操作 每個花序的5朵花僅保 留中心花 其他全部疏除 0040 所述方法中 移栽第5年得到所述目的植株 0041 所述目的植株為果肉全紅的植株 0042 所述目的植株為滿足如下 f1 和 或 f2 和 或 f3 和 或 f4 的蘋果植株 f1 果肉全紅 f2 果肉高類黃酮含量 f3 果肉高花青苷含量 f4 果肉高抗氧化能力 所述 果肉高類黃酮含量指的是每千克鮮重的果肉中的類黃酮的含量為5000mg以上 所述果肉高 花青苷含量指的是每千克鮮重的果肉中的花青苷含量為200mg以上 果肉高抗氧化能力指 的是每千克鮮重的果肉中的抗氧化能力 又稱抗氧化物含量 為3 mol以上 0043 本發(fā)明還保護蘋果 Malus domestica CSR6R6 666在蘋果育種中的應用 所述應 說 明 書 3 12 頁 6 CN 106613921 A 用中 蘋果CSR6R6 666作為親本之一 所述應用中 蘋果CSR6R6 666作為父本 所述育種的 目的為獲得果肉全紅的植株 0044 CSR6R6 666 又稱蘋果 Malus domestica CSR6R6 666 已于2017年2月17日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 簡稱CGMCC 地址為 北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號 中國科學院微生物研究所 保藏登記號為CGMCC NO 13783 0045 本發(fā)明加強芽變選種工作 建立雜交育種與芽變選種優(yōu)勢互補 常規(guī)技術與生物 技術有機結合的高效育種技術體系 對蘋果紅色性狀的持續(xù)改良具有重要意義 附圖說明 0046 圖1為紅富士 品種甲和品種乙的果皮中的花青苷檢測結果 0047 圖2為紅富士 品種甲和品種乙的果皮中的特異DNA分子甲基化水平檢測結果 0048 圖3為品種甲的照片 0049 圖4為品種乙的照片 0050 圖5為品種丁的照片 0051 圖6為嘎啦的照片 0052 圖7為品種己的照片 0053 圖8為蘋果新品系 功能1號 的照片 0054 圖9為蘋果新品系 功能2號 的照片 具體實施方式 0055 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明 但并不限定本發(fā)明 下述實施例中的實驗 方法 如無特殊說明 均為常規(guī)方法 下述實施例中所用的試驗材料 如無特殊說明 均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的 以下實施例中的定量試驗 均設置三次重復實驗 結果取平 均值 0056 著色指數(shù)指的是 成熟蘋果果實表皮 紅色區(qū)域面積占表皮總面積的比例 0057 蘆丁的結構式如下 0058 0059 Trolox的結構式如下 說 明 書 4 12 頁 7 CN 106613921 A 0060 0061 80 丙酮溶液 將4體積份丙酮與1體積份水混合 0062 1 鹽酸甲醇溶液 97 2ml甲醇與2 8ml濃鹽酸混合 濃鹽酸即市售12mol L鹽酸 0063 0 5 鹽酸甲醇溶液的制備方法 將0 5體積份35 濃鹽酸與99 5體積份甲醇混 合 0064 提及 紅富士 蘋果和 嘎啦 蘋果的參考文獻 陳學森 辛培剛等 元帥和金帥在蘋 果新品種選育中的作用 山東農(nóng)業(yè)大學學報 1994 25 2 236 248 0065 實施例1 通過持續(xù)多代芽變選種對蘋果紅皮性狀進行持續(xù)改良的方法的建立 0066 一 蘋果紅色芽變的特點 0067 調(diào)研發(fā)現(xiàn) 蘋果的紅色芽變具有如下三個特點 0068 1 蘋果紅色芽變的重演性 0069 調(diào)研發(fā)現(xiàn) 蘋果的紅色芽變可在國內(nèi)外不同地區(qū)及不同年份重復發(fā)生 表現(xiàn)出芽 變的重演性 這為有效利用芽變選種技術對蘋果紅皮性狀持續(xù)改良提供了科學依據(jù) 0070 2 蘋果紅色芽變的多效性 0071 對多個蘋果紅色芽變品種進行調(diào)研發(fā)現(xiàn) 盡管均是紅色芽變 但不同芽變品種 系 在著色類型 條紅或片紅 著色速度以及對光的敏感程度等存在明顯差異 這為有效 利用芽變選種技術選育特色多樣化品種 滿足消費者和栽培者的多樣化需求提供了科學依 據(jù) 0072 3 蘋果紅色芽變的穩(wěn)定性 0073 對多個蘋果紅色芽變品種嫁接繁殖后的穩(wěn)定性進行了調(diào)研 結果表明 蘋果紅色 芽變具有很好的遺傳穩(wěn)定性和一致性 這為蘋果紅色芽變品種的大面積推廣應用提供了科 學依據(jù) 0074 二 芽變的機理 0075 經(jīng)過發(fā)明人的大量研究 蘋果的紅色芽變是特異DNA分子甲基化水平差異引起的 表觀遺傳 特異DNA分子如序列表的序列1所示 0076 經(jīng)檢測 紅富士 蘋果和 嘎啦 蘋果的基因組中均具有序列表的序列1所示的特 異DNA分子 0077 三 通過持續(xù)多代芽變選種對蘋果紅皮性狀進行持續(xù)改良的方法的建立 0078 建立如下方法 將蘋果品種C0進行持續(xù)多代的芽變選種 第一代芽變選種將蘋果 品種CO作為出發(fā)品種 以后的每代芽變選種均將上一代芽變選種得到的品種作為出發(fā)品 種 每代芽變選種從全滿足如下三個性狀的芽發(fā)育出的枝條或植株中選擇目標品種 a 發(fā) 生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的花青苷含量為出發(fā)品種的2 倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的特異DNA分子的甲基化水平為出 發(fā)品種的二分之一以下 上述果皮均指的是成熟蘋果的果皮 0079 檢測果皮的花青苷含量的方法如下 說 明 書 5 12 頁 8 CN 106613921 A 0080 取0 5g果皮 液氮研磨 加入 ml 4 預冷的1 鹽酸甲醇溶液 4 避光靜置 提 取24h 0081 完成步驟 后 取提取液 分為兩份 每份1ml 一份加入4ml KCl緩沖液 另一份 加入4ml NaAC緩沖液 混勻后4 避光靜置提取15min 然后8000r min離心10min 收集上清 液 0082 KCl緩沖液 pH 1 0 025M 1 86g KCl用980ml蒸餾水溶解 用濃鹽酸調(diào)pH為1 0 轉移到1L容量瓶中 用蒸餾水定容 0083 NaAC緩沖液 pH 4 5 0 4M 54 43g NaAC用960ml蒸餾水溶解 用濃鹽酸調(diào)pH為 4 5 轉移到1L容量瓶中 用蒸餾水定容 0084 取步驟 得到的上清液 分別測定510nm和700nm下的吸光值 0085 花青苷含量 mg g A 5 0 005 1000 449 2 26900 0 5 0086 A A 510nm A700nm pH1 0條件下 A510nm A700nm pH4 5條件下 0087 mg g 中 mg指的是花青苷的質(zhì)量 指的是果皮鮮重 0088 檢測果皮的特異DNA分子的甲基化水平的方法如下 0089 利用QIAGEN植物基因組DNA抽提試劑盒提取果皮的基因組DNA 0090 取步驟 得到基因組DNA 采用EZ DNA Methylation Gold試劑盒進行亞硫酸鹽 轉化 得到亞硫酸鹽處理的DNA 0091 取步驟 得到的亞硫酸鹽處理的DNA 作為模板 分兩個體系進行PCR擴增 0092 PCR擴增體系 10 Ex Taq Buffer 2 5 l dNTP Mixture 2 l 引物F1 2 l 引物 R1 2 l TaKaRa Ex Taq HS 0 5 l 模板4 ddH 2O 12 l 0093 PCR擴增體系 的反應程序 94 預變性5分鐘 94 變性30秒 51 退火30秒 72 延伸1分鐘 共進行40個循環(huán) 72 延伸10分鐘 0094 PCR擴增體系 10 Ex Taq Buffer 2 5 l dNTP Mixture 2 l 引物F2 2 l 引 物R2 2 l TaKaRa Ex Taq HS 0 5 l 模板4 ddH 2O 12 l 0095 PCR擴增體系 的反應程序 94 預變性5分鐘 94 變性30秒 54 退火30秒 72 延伸1分鐘 共進行40個循環(huán) 72 延伸10分鐘 0096 引物F1 5 TAGGTTTGAAGAATTAATTAGGGAT 3 0097 引物R1 GGGAAATTTTGGTTTTTATATGGTTTAG 3 0098 引物F2 TTTTATTTTTTATATATATTATGTTATT 3 0099 引物R2 GGATTATGTTATTAGATGGT 3 0100 分別將步驟 的兩個體系的擴增產(chǎn)物進行測序 利用CyMATE軟件 Hetzl et al 2007 輸出甲基化水平數(shù)據(jù) 0101 特異DNA分子的甲基化水平 體系 的甲基化水平數(shù)據(jù) 體系 的甲基化水平數(shù) 據(jù) 2 0102 實施例2 應用實施例1建立的方法通過持續(xù)多代芽變選種對蘋果紅皮性狀進行持 續(xù)改良 0103 本實施例中檢測果皮的花青苷含量的方法和檢測果皮的特異DNA分子的甲基化水 平的方法同實施例1 0104 一 紅富士蘋果紅色芽變新品種選育 說 明 書 6 12 頁 9 CN 106613921 A 0105 1 第一代芽變選種 0106 將紅富士作為出發(fā)品種 將滿足如下三個性狀的芽發(fā)育出的枝條或植株作為初選 對象 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的花青苷含量為 紅富士的2倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的特異DNA分子的甲基 化水平為紅富士的二分之一以下 上述果皮均指的是成熟蘋果的果皮 0107 將初選對象進行復選和決選后 得到的某一個品種作為品種甲 0108 2 第二代芽變選種 0109 將品種甲作為出發(fā)品種 將滿足如下三個性狀的芽發(fā)育出的枝條或植株作為初選 對象 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的花青苷含量為 品種甲的2倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的特異DNA分子的甲基 化水平為品種甲的二分之一以下 上述果皮均指的是成熟蘋果的果皮 0110 將初選對象進行復選和決選后 得到的某一個品種作為品種乙 0111 紅富士 品種甲和品種乙的果皮中的花青苷檢測結果見圖1 品種甲的果皮的花青 苷含量為紅富士的2倍以上 品種乙的果皮的花青苷含量為品種甲的 倍以上 0112 紅富士 品種甲和品種乙的果皮中的特異DNA分子甲基化水平檢測結果見圖2 品 種甲的果皮的特異DNA分子的甲基化水平是紅富士的二分之一以下 品種乙的果皮的特異 DNA分子的甲基化水平是品種甲的二分之一以下 0113 紅富士的果皮顏色性狀 著色速度較慢 除袋之后10 15天著色 著色指數(shù)為 25 35 成熟果實表皮 25 35 顯示為淺紅色 剩余部分顯示為黃色或綠色 紅富士 的果肉顏色性狀 乳白色果肉 0114 品種甲的果皮顏色性狀 著色速度較快 除袋之后6 9天著色 著色指數(shù)為75 85 成熟果實表皮 75 85 顯示為鮮紅色 品種甲的照片見圖3 品種甲的果肉顏色性 狀 乳白色果肉 0115 品種乙的果皮顏色性狀 著色速度快 除袋之后3 4天著色 著色指數(shù)為90 以上 成熟果實表皮 90 以上為寶石紅色 品種乙的照片見圖4 品種乙的果肉顏色性狀 乳白 色果肉 0116 二 紅富士蘋果紅色 短枝雙芽變優(yōu)質(zhì)短枝型新品種選育 0117 1 第一代芽變選種 0118 將紅富士作為出發(fā)品種 將滿足如下四個性狀的芽發(fā)育出的枝條或植株作為初選 對象 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的花青苷含量為 紅富士的2倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的特異DNA分子的甲基 化水平為紅富士的二分之一以下 d 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的枝條的節(jié)間長度為 2cm以下 上述果皮均指的是成熟蘋果的果皮 0119 將初選對象進行復選和決選后 得到的某一個品種作為品種丙 0120 2 第二代芽變選種 0121 將品種丙作為出發(fā)品種 將滿足如下四個性狀的芽發(fā)育出的枝條或植株作為初選 對象 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的花青苷含量為 品種丙的2倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的特異DNA分子的甲基 化水平為品種丙的二分之一以下 d 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的枝條的節(jié)間長度為 說 明 書 7 12 頁 10 CN 106613921 A 2cm以下 上述果皮均指的是成熟蘋果的果皮 0122 將初選對象進行復選和決選后 得到的某一個品種作為品種丁 0123 紅富士的果皮顏色性狀 著色速度較慢 除袋之后10 15天著色 著色指數(shù)為 25 35 成熟果實表皮 25 35 顯示為淺紅色 剩余部分顯示為黃色或綠色 紅富士 的果肉顏色性狀 乳白色果肉 0124 品種丙的果皮顏色性狀 著色速度較快 除袋之后7 10天著色 著色指數(shù)為75 85 成熟果實表皮 75 85 顯示為鮮紅色 品種丙的果肉顏色性狀 乳白色果肉 品種 丙的短枝性狀 節(jié)間長度為2cm以下 0125 品種丁的果皮顏色性狀 著色速度快 除袋之后3 5天著色 著色指數(shù)為90 以上 成熟果實表皮 90 以上為濃紅色 品種丁的照片見圖5 品種丁的果肉顏色性狀 乳白色 果肉 品種丁的短枝性狀 節(jié)間長度為2cm以下 0126 三 嘎啦蘋果紅色芽變新品種選育 0127 1 第一代芽變選種 0128 將嘎啦作為出發(fā)品種 將滿足如下三個性狀的芽發(fā)育出的枝條或植株作為初選對 象 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的花青苷含量為嘎 啦的2倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的特異DNA分子的甲基化水 平為嘎啦的二分之一以下 上述果皮均指的是成熟蘋果的果皮 0129 將初選對象進行復選和決選后 得到的某一個品種作為品種戊 0130 2 第二代芽變選種 0131 將品種戊作為出發(fā)品種 將滿足如下三個性狀的芽發(fā)育出的枝條或植株作為初選 對象 a 發(fā)生紅色芽變 b 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的花青苷含量為 品種戊的2倍以上 c 芽發(fā)育成的枝條或植株上生長的蘋果的果皮的特異DNA分子的甲基 化水平為品種戊的二分之一以下 上述果皮均指的是成熟蘋果的果皮 0132 將初選對象進行復選和決選后 得到的某一個品種作為品種己 0133 嘎啦的果皮顏色性狀 著色速度較慢 除袋之后8 12天著色 著色指數(shù)為25 35 成熟果實表皮 25 35 顯示為淺紅色 剩余部分顯示為黃色或綠色 嘎啦的果肉 顏色性狀 乳白色果肉 嘎啦的照片見圖6 0134 品種戊的果皮顏色性狀 著色速度較快 除袋之后5 8天著色 著色指數(shù)為75 85 成熟果實表皮 75 85 顯示為鮮紅色 品種戊的果肉顏色性狀 乳白色果肉 0135 品種己的果皮顏色性狀 著色速度快 除袋之后3 5天著色 著色指數(shù)為90 以上 成熟果實表皮 90 以上為濃紅色 品種己的照片見圖7 品種己的果肉顏色性狀 乳白色 果肉 0136 實施例3 蘋果優(yōu)異種質(zhì) CSR6R6 666 的獲得和鑒定 0137 鑒定蘋果植株為R1R1基因型 R6R6基因型還是R6R1基因型的方法如下 從待測蘋 果植株上取蘋果 提取蘋果果肉的基因組DNA 以基因組DNA為模板 采用F3和R3組成的引物 對進行PCR擴增 然后按如下標準判讀基因型 如果PCR擴增產(chǎn)物為一條帶且為497bp 待測 蘋果植株為R6R6基因型 如果PCR擴增產(chǎn)物為一條帶且為386bp 待測蘋果植株為R1R1基因 型 如果PCR擴增產(chǎn)物為兩條帶且分別為497bp和386bp 待測蘋果植株為R6R1基因型 0138 F3 5 GGTGGTCAAAGATGTGTGTTGT 3 說 明 書 8 12 頁 11 CN 106613921 A 0139 R3 5 TTTGCCTGCTACCCACTTCA 3 0140 經(jīng)檢測 紅富士 蘋果和 嘎啦 蘋果均為R1R1基因型 0141 一 CSR6R6 666 的獲得 0142 新疆紅肉蘋果作為親本 與 紅富士 等白肉栽培蘋果品種雜交 按照孟德爾遺傳 定律 新疆紅肉蘋果 R6R1基因型 與 紅富士 R1R1基因型 等白肉栽培蘋果品種雜交 其 后代群體應為紅肉表型 R6R1基因型 白肉表型 R1R1基因型 1 1 但是 在雜交F 1代群 體中發(fā)現(xiàn)了R6R6基因型的單株 0143 將一株R6R6基因型的單株命名為 CSR6R6 666 0144 CSR6R6 666 具有如下表型 莖 葉 花 果皮和果肉等各部分及各個發(fā)育階段均 為紫紅色 0145 二 CSR6R6 666 的保藏 0146 CSR6R6 666 又稱蘋果 Malus domestica CSR6R6 666 已于2017年2月17日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 簡稱CGMCC 地址為 北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號 中國科學院微生物研究所 保藏登記號為CGMCC NO 13783 0147 三 CSR6R6 777 的保藏 0148 CSR6R6 777 是發(fā)明人所在的實驗室前期選育出來的另一株R6R6基因型的單株 0149 CSR6R6 777 又稱蘋果 Malus domestica CSR6R6 777 已于2016年12月08日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 簡稱CGMCC 地址為 北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號 中國科學院微生物研究所 保藏登記號為CGMCC NO 12468 0150 四 類黃酮組分含量分析 0151 分別將 CSR6R6 666 和 CSR6R6 777 作為待測植株 0152 1 取待測植株上的蘋果 取蘋果果肉 0153 2 取步驟1得到的果肉 在液氮中研磨得到粉末 0154 3 稱取2g步驟2得到的粉末 加入5mL 0 5 鹽酸甲醇溶液 4 靜置提取2h 然后 8000rpm離心20min 分別收集上清液和殘渣 0155 4 取步驟3得到的殘渣 加入5mL 0 5 鹽酸甲醇溶液 4 靜置提取1h 然后 8000rpm離心20min 收集上清液 0156 5 將步驟3得到的上清液和步驟4得到的上清液混合 得到混合液 0157 6 取步驟5得到的混合液 37 旋蒸除去甲醇 殘留物用2 3ml甲醇溶解 然后 8000rpm離心20min 收集上清液 0158 7 取步驟6得到的上清液 用甲醇定容至5ml 然后用0 45 m濾膜過濾 收集濾液 0159 8 將步驟7得到的濾液進行HPLC MS分析 0160 液相色譜條件 0161 采用WATERS ACQUITY UPLC色譜儀 色譜柱為BEH C18柱 100mm 2 1mm 填料粒 徑1 7 m 柱溫45 進樣體積1 L 0162 流動相為A液和B液的混合液 流速為0 3mL min A液為乙腈 B液為含0 2 體積 分數(shù) 甲酸的水溶液 0 0 1min A液占流動相的體積分數(shù)為5 0 1 20min A液占流動相的 體積分數(shù)由5 線性上升至20 20 22min A液占流動相的體積分數(shù)由20 線性上升至 80 22 22 1min A液占流動相的體積分數(shù)由80 線性下降至5 22 1 25min A液占流動 說 明 書 9 12 頁 12 CN 106613921 A 相的體積分數(shù)為5 0163 質(zhì)譜條件 0164 質(zhì)譜儀為WATERS MALDI SYNAPT Q TOF MS ESI電離源 電噴霧離子化正離子采集 模式 ESI 掃描范圍100 1500m z 毛細管電壓3 5kV 錐孔電壓30V 源溫度100 脫溶溫 度300 脫溶劑氣流量500L h 0165 9種特定黃酮醇物質(zhì)的含量見表1 表 中的9種特有物質(zhì)的檢測方法均屬于類黃酮 組分及含量檢測方法 參考文獻 陳學森 張晶 劉大亮 等 新疆紅肉蘋果雜種一代的遺傳 變異及功能型蘋果優(yōu)株評價 J 中國農(nóng)業(yè)科學 2014 47 11 2193 2204 0166 表1 0167 0168 0169 以上結果表明 CSR6R6 666 和 CSR6R6 777 均具有很強的類黃酮合成能力 果 肉富含類黃酮 并且含有特殊的黃酮醇類組分 是培育功能型蘋果品種的優(yōu)異種質(zhì) CSR6R6 666 優(yōu)于 CSR6R6 777 0170 實施例4 芽變選種和雜交育種有機結合培育 功能1號 功能型蘋果新品系 0171 一 功能型蘋果新品系 0172 1 回交 在山東煙臺市牟平區(qū)進行 0173 2011年4月 取 CSR6R6 666 的花粉 對去雄后的品種乙進行授粉 收獲BC 1雜交種 子 將BC 1雜交種子洗凈后放到1 3 冰箱保鮮室層積處理60d左右 目的是通過滿足需冷量 來解除種子休眠 0174 2 溫室育苗 在山東泰安進行 0175 2011年12月 將步驟1得到的BC 1雜交種子播種于裝有育苗基質(zhì)的營養(yǎng)缽 每個營 養(yǎng)缽播種3 5粒種子 培養(yǎng)至實生苗高度為8 15cm且根頸處木質(zhì)化 通常為播種2 3個月 然后將實生苗移栽至新的裝有育苗基質(zhì)的營養(yǎng)缽 每個營養(yǎng)缽移栽1株 進行培養(yǎng) 本步驟 中的培養(yǎng)條件為 25 每天光照12小時 光照強度3000lx 從種子萌發(fā)開始每7 10天澆一 次營養(yǎng)液 將MS基本培養(yǎng)基的大量元素母液用水稀釋至10倍體積即為營養(yǎng)液 每次每個營 養(yǎng)缽澆40 50ml 說 明 書 10 12 頁 13 CN 106613921 A 0176 3 雜種實生苗定植 在山東冠縣進行 0177 2012年2月 在擬定植實生苗的選種圃 大田 中每畝施入有機肥 本實施例中采用 的為充分腐熟的奶牛糞 6000kg并澆水沉實 2012年4月 將3600株步驟2得到的實生苗定植 于選種圃 2012年4月在定植有實生苗的選種圃中每畝再施入有機肥 本實施例中采用充分 腐熟的奶牛糞 6000kg并及時澆水 0178 4 雜種實生苗環(huán)剝處理 0179 2015年5月 在離地面20cm處對各實生苗的主干進行環(huán)剝 環(huán)剝寬度為0 5 1 0cm 深達木質(zhì)部 此操作的目的是促進營養(yǎng)物質(zhì)的積累及花芽分化 以縮短童期 提早結果 0180 5 花果管理 0181 2016年4 5月 在各實生苗的盛花期進行疏花 每個花序的5朵花僅保留中心花 其 他全部疏除 幼果不套袋 常規(guī)管理 0182 6 功能型蘋果新品系 功能1號 的獲得 0183 20