草莓灰霉病菌拮抗放線菌的篩選及活性測定.pdf

    北方園藝（）： 研究論文第一作者簡介：趙娟（），女，博士，助理研究員，研究方向為微生物資源利用與果蔬病害生物防治。：責任作者：劉偉成（），男，博士，研究員，研究方向為資源微生物及植物病害生物防治。：基金項目：北方果樹病蟲害綠色防控北京市重點實驗室資助項 目 （）；北 京 市 科 技 計 劃 資 助 項 目（，）；北京市優(yōu)秀人才資助項目（）；北京市農(nóng)林科學院所級創(chuàng)新團隊資助項目（）。收稿日期：草莓灰霉病菌拮抗放線菌的篩選及活性測定趙娟，賈 衛(wèi) 國，劉 偉 成，劉 德 文，張 殿 朋，盧 彩 鴿（北京市農(nóng)林科學院 植物保護環(huán)境保護研究所，北京；固安縣牛駝鎮(zhèn)林城駐軍生產(chǎn)基地，河北 廊坊）摘要：以分離自新疆古爾班通古特沙漠土壤的放線菌為試材，采用瓊脂塊法和生長速率法，研究了供試放線菌對草莓灰霉病菌的抑菌活性；采用形態(tài)學特征、生理生化特性、序列分析等方法對篩選出的高活性拮抗菌株進行種類鑒定。結果表明：從株放線菌中篩選出株對草莓灰霉病菌的抑菌圈直徑為的高活性拮抗菌株。該菌株無菌發(fā)酵濾液對多種植物病原真菌具有明顯抑制作用，抑菌率為；處理其抑菌率未見明顯變化，在 范圍內(nèi)其抑菌活性穩(wěn)定，在可見光和紫外線照射內(nèi)亦保持良好的抑菌活性。拮抗菌株經(jīng)鑒定為唐德鏈霉菌（ ）。拮抗放線菌具有廣譜抑菌活性，對環(huán)境有良好的穩(wěn)定性，可作為防治果蔬草莓灰霉病的生物農(nóng)藥潛力菌株進行開發(fā)應用。關鍵詞：草莓灰霉病菌；唐德鏈霉菌；抑菌活性；發(fā)酵液穩(wěn)定性中圖分類號： ； 文獻標識碼： 文章編號：（）灰霉病是草莓開花后危害最嚴重的一種真菌性病害，該病害由灰葡萄孢（ ）侵染引起，主要危害果實、果梗、花瓣、葉片和葉梗，在草莓生產(chǎn)中嚴重降低了果實的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前生產(chǎn)上防治果蔬灰霉病仍以化學防治為主，雖然防治效果比較顯著，但是長期大量使用化學農(nóng)藥造成了病原菌產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染等系列問題。生物防治以其環(huán)境友好，成本低、無污染等特點被人們所重視，因此關于篩選和利用拮抗微生物防治果蔬灰霉病已成為研究熱點。李德全等篩選到株對草莓灰霉病具有較好防治效果的枯草芽孢桿菌（）。黃靜等從草莓根際土壤中分離到株解淀粉芽孢桿菌，該菌株對草莓灰霉病具有明顯抑菌作用。秦曉杰等從草莓果實， ， ， ： ； ； ； 上分離篩選到株對灰霉病具有明顯抑制效果的拮抗酵母菌季也蒙畢赤酵母（ ）。但由于灰霉病具有適應性強、繁殖速度快、病原菌易變異等特點，因此從實際生產(chǎn)中不斷尋找新的不同種類的拮抗微生物資源是一項長期且重要的工作。放線菌是土壤中廣泛分布的微生物，可產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)和胞外水解酶從而抑制病原菌生長或溶解病原菌菌體，是具有生物農(nóng)藥開發(fā)潛力的微生物。孫平平等研究表明，分離自果樹根際土壤的多產(chǎn)色鏈霉菌（ ）處理梨果實能顯著降低梨灰霉病菌的擴展，并提高了果實的防御酶系活性。朱海云等采用平皿滲透法篩選出株對獼猴桃細菌性潰瘍病具有生防潛力的內(nèi)生放線菌，其中肉桂地鏈霉菌（ ）發(fā)酵液倍稀釋處理獼猴桃植株，對獼猴桃細菌性潰瘍病的防效可達。但是目前利用放線菌進行草莓灰霉病防治的研究相對較少。根據(jù)課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，分離自新疆通古特沙漠土壤的可培養(yǎng)放線菌類群具有豐富的多樣性。該研究以草莓灰霉病菌為靶標，通過瓊脂塊法篩選出高活性拮抗放線菌，并對其種類進行鑒定；在此基礎上對該拮抗菌的抑菌譜和發(fā)酵液穩(wěn)定性進行研究，以確定該菌株抑菌作用廣譜性和抑菌活性成分對不同環(huán)境因素的耐受能力，為草莓灰霉病綠色防控中高效微生物農(nóng)藥的開發(fā)應用提供菌株資源和科學依據(jù)。 材料與方法 試驗材料供試放線菌由北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所生防微生物研究室分離自新疆通古特沙漠特殊生境土壤。供試靶標菌草莓灰霉病菌（ ），由該研究室分離自京郊科技園區(qū)保護地草莓發(fā)病果實。其它供試植物病原真菌包括番茄灰霉病菌（ ）、桃褐腐病菌（ ）、番茄葉霉病菌（ ）、辣椒炭疽病菌（ ）、小麥紋枯病菌 （ ）、黃瓜 枯 萎 病 菌（ ）、甘藍枯萎病菌（ ），均由北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所生防微生物研究室保存。供試培養(yǎng)基：病原真菌培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（）；放線菌培養(yǎng)采用高氏一號培養(yǎng)基；放線菌發(fā)酵液制備采用高氏一號液體培養(yǎng)基。 試驗方法 放線菌分離培養(yǎng)采用稀釋平板法分離放線菌。根據(jù)程麗娟等的方法進行土壤懸浮液的制備和梯度稀釋，吸取不同濃度的懸浮液各加到高氏一號培養(yǎng)基（加入終濃度為的）平板上，涂布均勻后置于培養(yǎng)觀察，后挑取不同的單菌落劃線純化。將純化后的菌株轉(zhuǎn)接到高氏一號斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?草莓灰霉病菌拮抗放線菌篩選采用瓊脂塊法進行草莓灰霉病菌拮抗放線菌的篩選。培養(yǎng)后十字交叉法測量抑菌圈直徑。 拮抗菌種類鑒定）形態(tài)學觀察和生理生化指標的檢測。將供試拮抗菌接種于國際鏈霉菌計劃（）指定的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)觀察菌株生長情況，記錄氣生菌絲、基內(nèi)菌絲顏色以及可溶性色素的有無及顏色。將滅菌的蓋玻片斜插入高氏一號培養(yǎng)基內(nèi)，供試菌株劃線接種于蓋玻片內(nèi)側，培養(yǎng)取出蓋玻片在倍光學顯微鏡下觀察菌絲、孢子形態(tài)。菌株碳源利用試驗與生理生化反應參照文獻。）分子生物學鑒定。采用細菌基因組提取試劑盒提取供試拮抗菌基因組。細菌通用引物：和：擴增菌株序列。擴增體系：上下游引物各， （），聚合酶， ，基因組模板， 。擴增產(chǎn)物用的瓊北方園藝月（下）脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶經(jīng)切膠回收純化后，送至北京博邁德生物技術有限公司測序。對獲得的序列提交數(shù)據(jù)庫，并采用在網(wǎng)站進行序列相似性搜索。采用 軟件進行多序列比對，利用 軟件中法構建系統(tǒng)進化樹。 項目測定 拮抗菌抑菌譜的測定采用生長速率法對獲得的高活性菌株進行抑菌譜測定，抑菌率（）（對照菌落直徑處理菌落直徑）對照菌落直徑。 拮抗菌活性產(chǎn)物穩(wěn)定性的測定）對溫度穩(wěn)定性的測定。將供試菌株的無菌發(fā)酵濾液在、條件下，處理；在條件下，高壓蒸汽滅菌處理，快速冷卻。）對酸堿穩(wěn)定性的測定。將供試菌株無菌發(fā)酵濾液裝入離心管，用已經(jīng)配好的鹽酸和氫氧化鈉分別調(diào)節(jié)，使各組分別為、，放置后調(diào)回至初始。）對可見光和紫外光穩(wěn)定性的測定。將供試菌株無菌發(fā)酵濾液在可見光和波長為的紫外燈處，分別照射、。以上個項目均以草莓灰霉病菌為指示菌，采用生長速率法測定不同處理后無菌發(fā)酵濾液的抑菌率，每處理重復次。 數(shù)據(jù)分析采用 軟件作圖并對試驗數(shù)據(jù)進行分析，采用軟件進行差異顯著性分析。 結果與分析 草莓灰霉病菌拮抗放線菌篩選采用稀釋平板法從采集自新疆通古特沙漠的土樣中分離純化共得到株放線菌，又通過瓊脂塊法篩選到株對草莓灰霉病菌具有良好抑菌活性的放線菌，其中菌株對草莓灰霉病菌的抑菌圈直徑最高，為（表），因此利用菌株進行后續(xù)試驗。表供試放線菌對草莓灰霉病菌的抑菌活性  菌株編號 抑菌圈直徑 菌株編號 抑菌圈直徑                                     拮抗菌種類 形態(tài)學觀察和生理生化特性菌株在甘油硝酸鹽瓊脂、淀粉瓊脂、蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上無氣生菌絲，在馬鈴薯蔗糖瓊脂、高氏一號瓊脂以及、培養(yǎng)基上氣生菌絲呈白色或白灰色，在葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基上氣生菌絲呈肉桂褐色；各培養(yǎng)基中基內(nèi)菌絲淺黃色至深褐色；菌株在甘油硝酸鹽瓊脂、馬鈴薯蔗糖瓊脂、淀粉瓊脂、蔗糖察氏瓊脂、培養(yǎng)基上無可溶性色素，在高氏一號、葡萄糖天門冬素瓊脂、培養(yǎng)基上可溶性色素呈淺黃色、褐色或深褐色（表）。通過光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在高氏一號培養(yǎng)基上，菌株菌絲細長、發(fā)達、不斷裂、多分枝，孢子卵圓形至橢圓形，呈鏈狀（圖）。 第期北方園藝表拮抗菌在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征 培養(yǎng)基氣生菌絲 基內(nèi)菌絲 可溶性色素 甘油硝酸鹽瓊脂 淺黃色 馬鈴薯蔗糖瓊脂 白色 褐色 高氏一號瓊脂白色 深褐色 褐色葡萄糖天門冬素瓊脂 肉桂褐色 淺黃 淺黃色淀粉瓊脂 淺黃 蔗糖察氏瓊脂 淺黃 酵母膏麥芽膏瓊脂 白灰色 褐色 深褐色燕麥粉瓊脂白灰色 淺黃 無機鹽淀粉瓊脂 白灰色 淺黃 淺黃色注：箭頭指菌株產(chǎn)生的孢子鏈。： 圖拮抗菌菌落（）、菌絲（）及孢子鏈（）形態(tài)特征 （），（） （） 根據(jù)碳源利用和生理生化特性檢測結果，菌株能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、甘露醇、肌醇、蔗糖，不能利用半乳糖、棉子糖；明膠液化、淀粉水解微弱，不產(chǎn)生類黑色素和硫化氫。 分子生物學鑒定結果將拮抗菌的基因進行擴增測序，得到 的序列，將其序列相關信息提交到，獲得登錄號。進行比對后選取與菌株同源性較高的序列，通過進化樹發(fā) 現(xiàn) 菌 株與 （、）聚在同一分支，相似性達到（圖）。由此結合形態(tài)學特征和培養(yǎng)特征，將菌株鑒定為唐德鏈霉菌（ ）。 拮抗菌抑菌譜由表可知，菌株對株供試植物病原真菌生長具有抑制作用，抑菌圈直徑為；對草莓灰霉病菌、桃褐腐病菌和黃瓜枯萎病菌的抑制效果較明顯，抑菌率分別為、和。 拮抗菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性 溫度由圖可知，菌株無菌發(fā)酵濾液在及以下溫度處理后依然保持較高的抑菌活性（），且與對照差異不顯著。經(jīng)高溫處理后，發(fā)酵液抑菌率明顯下降，但仍能達到；在高壓蒸汽滅菌處理后，發(fā)酵液抑菌率急速下降至，這個處理均顯著低于對照。說明菌株發(fā)酵液在溫度低于的環(huán)境條件下具有較好的熱穩(wěn)定性。北方園藝月（下）圖基于序列的拮抗菌系統(tǒng)進化分析 表菌株對植物病原真菌的抑制效果 植物病原真菌 抑菌圈直徑 抑菌率 草莓灰霉病菌    桃褐腐病菌    辣椒炭疽病菌    黃瓜枯萎病菌    番茄灰霉病菌    番茄葉霉病菌    小麥紋枯病菌    甘藍枯萎病菌     光照由圖可知，拮抗菌無菌發(fā)酵濾液對可見光和紫外光具有較好的穩(wěn)定性，在連續(xù)照射后，抑菌活性較對照均沒有顯著性差異。當紫外光照射時間不斷延長，抑菌活性呈逐漸降低趨勢，但處理時菌株無菌發(fā)酵濾液抑菌活性仍然維持在。說明菌株無菌濾液的對可見光和紫外光穩(wěn)定，在田間應用時可保持較好的抑菌活性。 由圖可知，拮抗菌無菌發(fā)酵濾液在為時具有較強的抑菌活性，抑菌率保持在。發(fā)酵液在低于或高于時，其抑菌作用下降較明顯；在為和時抑制率明顯降低（），但抑制率仍可達到和。說明菌株無菌發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)對酸堿條件有較強的耐受性。 結論與討論從放線菌及其次生代謝產(chǎn)物中篩選廣譜、穩(wěn)定、低毒的農(nóng)用抗生素在植物病害綠色防控具有廣闊的應用前景。由于從普通環(huán)境中篩選出的放線菌抑菌活性低且同種屬菌株重復性高，研究人員對一些極端環(huán)境中的放線菌資源進行了探究。新疆通古特沙漠西部和中部以中亞荒漠植被區(qū)系占優(yōu)勢，蘊藏有豐富的微生物資源。該研究從分離自新疆通古特沙漠的株放線菌中篩選到株對草莓灰霉病菌具有高抑菌活性的廣譜拮抗放線菌，并鑒定為鏈霉菌屬唐德鏈霉菌（ ）。從唐德鏈霉菌發(fā)酵 第期北方園藝圖不同溫度（）、光照（）、（）處理對拮抗菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響 （），（） （） 液中分離到的核苷肽次級代謝產(chǎn)物尼可霉素（）是幾丁質(zhì)合成酶的競爭性抑制劑，抗真菌活性強但抗菌譜相對較窄，主要應用于醫(yī)藥領域。林真亭等研究表明，從海洋放線菌庫中篩選到的唐德鏈霉菌（）對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有顯著抗菌活性，其產(chǎn)生的抗菌活性化合物為環(huán)二肽衍生物。該研究中菌株及其產(chǎn)生活性物質(zhì)對草莓灰霉病菌、桃褐腐病菌、黃瓜枯萎病菌等多種重要植物病原真菌均具有明顯的抑菌活性。由此推測分離自新疆特殊生境的 菌株發(fā)酵液中可能含有新的抑菌活性物質(zhì)，但其具體類型還需對其活性產(chǎn)物進行進一步的分離純化和結構鑒定研究。拮抗微生物及其產(chǎn)生的活性抑菌物質(zhì)無論是施用到作物表面還是進入植物根際土壤，都要受到溫度、光照及土壤酸堿性的影響。因此微生物次生代謝產(chǎn)物在自然環(huán)境中的穩(wěn)定性直接生產(chǎn)菌種作為生物農(nóng)藥進行開發(fā)應用。該研究結果表明，發(fā)酵液耐高溫，在強酸堿條件下較穩(wěn)定，在可見光及紫外光處理后，對指示菌依然具有顯著抑菌活性，說明菌株發(fā)酵液中的抗菌活性物質(zhì)具有較強的熱、酸堿和光穩(wěn)定性。綜上所述，將唐德鏈霉菌（ ）活菌及其活性代謝產(chǎn)物作為防治果蔬作物灰霉病的生物農(nóng)藥具有一定的應用價值和開發(fā)前景。參考文獻秦曉杰，許皎姣，索娜，等草莓灰霉病拮抗酵母菌的篩選鑒定及對采后草莓品質(zhì)的影響食品工業(yè)科技，（）：高翠珠，楊紅玲，黃夏宇騏，等湖北省設施草莓灰霉病發(fā)生規(guī)律及流行因子分析中國農(nóng)業(yè)科學，（）： 劉永春，張紅玲腈苯唑與氟啶胺混劑防治草莓白粉病和灰霉病農(nóng)藥，（）： ， ， ， ，（）：孫平平，賈曉輝，崔建潮，等梨灰霉病拮抗的篩選、鑒定及作用機制研究園藝學報，（）：李德全，錢亞明，周鳴鳴，等海洋細菌防治草莓灰霉病機理及其抗菌物質(zhì)分析植物保護學報，（）： 黃靜，趙佳，陳哲，等抗草莓灰霉病的芽孢桿菌的分離與篩選北方園藝，（）：邱并生灰葡萄孢分生孢子產(chǎn)生相關基因的功能分析微生物學通報，（）：張志斌，敖武，熊瑤瑤，等內(nèi)生拮抗放線菌的鑒定及抑菌活性物質(zhì)的分離微生物學通報，（）： 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