番茄ShARPC5抗白粉病功能分析.pdf

中國農業(yè)科學 2020 53 1 65 73 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2020 01 006 收稿日期 2019 07 10 接受日期 2019 08 21 基金項目 國家自然科學基金 31571960 陜西省重點產業(yè)創(chuàng)新鏈項目 2019ZDLNY03 07 西 北 農 林 科 技 大 學 試 驗 示 范 站 基 地 科 技創(chuàng)新與 成果 轉化項目 2018 10 高等學校學科 創(chuàng)新引智計劃 B07049 聯(lián)系方式 馮嬋婧 E mail fcj413 通信作 者王陽 E mail wangyang2006 通信作者馬青 E mail maqing 開放科學 資源服務 標識碼 OSID 番茄ShARPC5抗白粉病功能分析 馮嬋婧 孫廣正 王陽 馬青 西北農林科技大學植物保護學院 旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室 陜西楊凌 712100 摘要 目的 白粉病 powdery mildew 是番茄生產上的重要病害 嚴重影響番茄的產量 番茄基因組測 序工作的完成為抗病基因挖掘提供了重要的信息資源 ARP2 3 actin related protein 2 and 3 復合體是肌動 蛋白微絲骨架動力學的主要調控因子 能夠參與包括響應外界脅迫等多種細胞學過程 本研究通過對番茄 ARPC5 actin related protein C5 進行克隆和抗病功能驗證 為番茄基因組信息完善 抗病機制解析和分子育種等 方面打下基礎 方法 從番茄LA1777 Solanum habrochaites cDNA中 PCR擴增ShARPC5 使用DNAMAN 6 0進 行多序列比對 MEGA 6 0構建系統(tǒng)發(fā)育樹 應用在線工具ProtComp v 9 0進行亞細胞定位預測 利用實時熒光 定量PCR qRT PCR 比較接種白粉菌 Oidium neolycopersici On Lz 后高感品種Moneymaker MM 和高抗品 種 LA1777 中番茄 ARPC5 的表達特征 分析白粉菌侵染與 ARPC5 表達的相關性 應用病毒誘導的基因沉默 virus induced gene silencing VIGS 技術進一步驗證該基因在番茄中的抗病功能 觀察沉默株和野生型株 系接種后表型變化 利用臺盼藍和 DAB 染色法檢測植株產生過敏性壞死和 H2O2的能力 并檢測 ShARPC5 沉默后一 些與植物抗病相關標記基因的表達變化 采用農桿菌浸花法遺傳轉化擬南芥過表達 ShARPC5 植株 觀察轉基因和 野生型株系接種后表型變化 并統(tǒng)計單病斑分生孢子數(shù) 結果 從番茄品種LA1777 中克隆到ShARPC5 編碼132 個氨基酸殘基 包含一個保守的P16 Arc結構域 與番茄MM 白粉菌親和互作相比 非親和互作的番茄品種LA1777 在接種白粉菌后 ShARPC5顯著上調表達 尤其在接種后18 h 在番茄上沉默ShARPC5能夠增加植株對白粉菌On Lz 的敏感性 防衛(wèi)反應基因 PR1b1 顯著下調表達 組織學觀察顯示與對照植株相比 ShARPC5 沉默植株接種后誘導 產生過敏性壞死和活性氧減少 在煙草上瞬時過表達 ShARPC5 能夠誘導產生壞死斑 相反 在擬南芥上過表達 ShARPC5能夠增加植物的抗病性 結論 ShARPC5是番茄響應白粉菌侵染的重要基因 可減輕番茄白粉病的發(fā)病 程度 在番茄抗白粉病機理研究方面具有較大的應用價值 可作為番茄抗白粉病分子育種的一個候選基因 關鍵詞 番茄白粉病 抗病性 肌動蛋白微絲骨架 ARP2 3復合體 ARPC5 Functional Analysis of Gene ShARPC5 Involved in Tomato Resistance to Powdery Mildew FENG ChanJing SUN GuangZheng WANG Yang MA Qing College of Plant Protection Northwest A F University State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas Yangling 712100 Shaanxi Abstract Objective Powdery mildew is an important disease in tomato production and seriously affects the yield of tomato Genome sequences of Solanum lycopersicum provide valuable information resources for disease resistant gene searching The actin related protein 2 and 3 complex ARP2 3 complex a key regulator of actin cytoskeletal dynamics has been linked to multiple 6 6 中 國 農 業(yè) 科 學 5 3 卷 cellular processes including those associated with response to stress In this study tomato ARPC5 encoding a subunit protein of the ARP2 3 complex was cloned and identified for disease resistance The results will lay a foundation for upgrading tomato genomic information further studying the resistance mechanism and molecular breeding Method ShARPC5 was annotated from the genomic databases and cloned from tomato LA1777 S habrochaites DNAMAN 6 0 was used for multiple sequence alignment and MEGA 6 0 was used for constructing phylogenetic tree The prediction of protein subcellular localization was performed using ProtComp v 9 0 The qRT PCR was used to compare the expression of ARPC5 in the high sensitive variety Moneymaker MM and high resistant variety LA1777 induced by Oidium neolycopersici On Lz The correlation between On Lz infection and ARPC5 expression was analyzed The function of ShARPC5 involving in tomato resistance to On Lz was further verified by the technology of virus induced gene silencing VIGS The phenotypic changes of ShARPC5 silenced and wild type lines were observed Hypersensitive response HR and H 2 O 2 production were detected by trypan blue and DAB staining respectively and the expression of some marker genes related to plant disease resistance was assayed in ShARPC5 silenced plants Additionally genetic transformation of Arabidopsis thaliana was conducted by Agrobacterium mediated floral dip method The phenotypic changes of transgenic and wild type lines were observed and the number of conidia per lesion was also counted Result The S habrochaites ARPC5 was identified and characterized ShARPC5 encodes a 132 amino acid protein possessing a conserved P16 Arc domain Compared with the compatible interaction between tomato MM Moneymaker and On Lz the expression of ShARPC5 was significantly up regulated in incompatible interaction between tomato LA1777 and On Lz especially at 18 hpi Silencing of ShARPC5 in tomato could increase the susceptibility to the powdery mildew pathogen On Lz The expression of PR1b1 a maker gene related to signal regulation was significantly down regulated after silencing of ShARPC5 The histological observation showed that the induction of hypersensitive cell death and the generation of reactive oxygen were reduced in silenced ShARPC5 tomato plants compared with wild types Transient over expression of ShARPC5 in tobacco could rapidly produce necrotic spots Conversely over expression of ShARPC5 in A thaliana followed by inoculation with On Lz showed enhanced resistance Conclusion ShARPC5 is an important gene which can reduce the incidence of tomato powdery mildew and has a great application value in the mechanism study of tomato resistance to powdery mildew At the same time it can be used as a candidate gene for molecular breeding of tomato powdery mildew resistance Key words tomato powdery mildew resistance actin cytoskeleton ARP2 3 complex ARPC5 0 引言 研究意 義 番茄白粉 菌 Oidium neolycopersici 是一種活體營養(yǎng)寄生菌 能在番茄葉表面 背面 葉 柄和花萼上產生白粉病斑 但不侵染果實 它通過影 響植物的葉片使葉片失去生長活力 能導致產量 果 實 損失 高 達 50 1 目 前 在溫 室和 大田中對 番茄 白粉病的控制主要依賴于化學農藥 然而 化學藥劑 不僅增加病原菌抗藥性 也通過果實中農藥的殘留對 環(huán)境和人體造成危害 2 大多數(shù)栽培番茄易受白粉菌 侵染 控制番茄白粉病的有效策略是培育抗性品種 前人研究進展 目前 野生番茄品種中一些抗性基 因已經被鑒定并轉入栽培番茄 包括 5 個顯性基因 Ol 1 Ol 3 Ol 4 Ol 5 Ol 6 1 個 隱性基 因 ol 2 和 3 個多 基 因抗性數(shù) 量性 狀基因座 quantitative trait locus QTLs 3 研 究發(fā) 現(xiàn)抗性基 因介 導的對番 茄白 粉病的抗 病性 與過敏性 壞死 hypersensitive response HR 有 關 3 當細胞 產 生 HR 時 未 受感染的 鄰近 細 胞顯示肌動蛋白微絲 actin filaments AFs 聚集現(xiàn) 象 4 AFs 是 形成肌動 蛋白 細胞骨架 的主 要結構元 件 既能將質膜和細胞壁上的物質通過囊泡的靶向輸送轉 運到生長位點 也能特異性的轉運防衛(wèi)相關物質形成 抵御病原 菌侵 入的屏障 5 6 肌動蛋白 組成 的關鍵步 驟 是肌動蛋白成核 而肌動蛋白成核在很大程度上受 ARP2 3 actin related protein 2 and 3 復合 體的活性 調 節(jié) 這能 確保 AFs 正確形 成 7 ARP2 3 復 合 體包含 7 個亞基 分 別 為 ARP2 ARP3 ARPC1 ARPC5 該 復 合體是一種高度保守的肌動蛋白調節(jié)劑 能核化與質膜 區(qū)域相關的分支狀的肌動蛋白網(wǎng)絡 也能促進特定細胞 器和細胞骨架的耦合 在核內和細胞質間提供某種形式 的物理連續(xù)性 8 ARP2 3 復合體不同亞基在發(fā)育過程 中起著不同的作用 例如 ARP2 對膜結合是必不可少 的 9 ARP3 在體內定位于肌動蛋白成核部位 10 ARPC1 或 ARPC2 的缺 失導 致釀酒酵 母的 致死性和 生 存能力嚴 重下 降 擬南 芥 Arabidopsis thaliana ARP3 或 ARPC5 的功能喪失導致根毛短小且彎曲 11 12 ARPC4 是控制 ARP2 3 復合體組裝和穩(wěn)定性的最關 鍵亞基 9 ARPC4 和 ARPC5 在介導與 ABA 和 H 2 O 2 誘導的保衛(wèi)細胞肌動蛋白動力學中起關鍵作用 13 本研究切入點 ARP2 3 復合體的亞基除了能夠參 1 期 馮嬋婧等 番茄 ShARPC5 抗白粉病功能分析 67 與植物生長發(fā)育和結構組成 較少的研究證實其參 與植物的抗病性 14 西北農林科技大學植物保護學 院 植 物 病害綜合治理團隊發(fā)現(xiàn)白粉菌 On Lz 與番 茄 Moneymaker MM Solanum lycopersicum 形 成 親和互作 而與番茄 LA1777 S habrochaites 非 親 和互作 在非親和互作體系中番茄 ARPC5 受白粉菌 誘導顯著上調表達 推測其可能參與抗白粉菌侵染 的過程 擬解決的關鍵問題 通過對 ShARPC5 進 行克隆 生物信息學分析 差異性誘導表達 VIGS 分析 煙草瞬時表達 擬南芥過量表達以及酵母突 變體異源互補等方面的研究 為進一步揭示其抗病 機制打下基礎 1 材料與方法 試驗于 2016 2018 年在 西北農林科技大學植物 保護學院 植物 病害綜合 治理 實驗室完 成 1 1 試驗材料 番茄白粉 菌菌 株 On Lz 采 自 甘肅省蘭 州市 分離 保存在栽 培番 茄 Moneymaker MM 上 生長溫 度 20 3 相對濕度 70 5 16 h 光照 8 h 黑 暗 番茄 MM 和 On Lz 構成親 和互作體 系 LA1777 和 On Lz 構 成 非親和互 作體 系 番 茄種子 消毒后 在 25 95 相 對濕度 和 3 500 lx 光照 下生 長 15 生態(tài) 型擬南 芥 Columbia 0 Col 0 購自 擬南 芥生物資 源中 心 Ohio 按 照 WU 等 16 的方法對 擬 南芥種子 進行 消毒和催 芽 發(fā)芽和生 長分 別在 21 和 19 生 長室 8 h 光照 16 h 黑暗 相 對濕 度為 70 1 2 生物信息學分析 以擬南 芥 ARPC5 序列號 NP 567216 1 氨 基 酸序列作 為指 示查詢序 列在SGN Tomato Combined 數(shù) 據(jù)庫 TBLASTN 程 序 GenBank 的 BLASTN http blast ncbi nlm nih gov blast cgi 程序搜索 同源 序列 利用 NCBI http www ncbi nlm nih gov gorf gorf html 的 BLAST 程序 和基因開 放式 閱讀框 ORF 分 析 ShARPC5 的 cDNA 序列 使 用 DNAMAN6 0 進行多序 列比 對 用 MEGA 6 0 軟 件的鄰 近法進行 系統(tǒng) 發(fā)育分析 蛋 白質結構 域預 測使用 RCSB PDB 蛋白 質 數(shù)據(jù)庫 https www rcsb org 利用 ProtComp 程序 v 9 0 http linux1 softberry com berry phtml 預測 ShARPC5 蛋 白亞 細胞定位 1 3 煙草瞬時過表達 利用 ShARPC5 TF 5 AGCATCGATTCCCGGG TCGACATGGCTGAGATTGTCGAAGCAGATA 3 下劃線為 載體 同源臂 和 ShARPC5 TR 5 AACCGT TCATCGGCGGTCGACTCACACAGTATTCACAGT GTCAGCA 3 下劃 線為載 體同源臂 擴 增 ShARPC5 的 ORF 將 擴增產物 同源 重組到 PGR106 載體的 SalI 酶切位點 由 CaMV35S 啟動子驅 動 參照 LU 等 17 的方法將 重組 質粒 pGR106 ShARPC5 或 pGR106 GFP 陰性對 照 電轉至根 癌農 桿菌 GV3101 中 將轉 化 子處理后 在黑 暗中培 養(yǎng) 2 3 h 然后 注射 到煙草葉 片 接種后 5 7 d 對 表型進 行 觀察 1 4 病毒誘導基因沉默 利用 ShARPC5 VF 5 AGAAGGCCTCCATGGG GATCCCGAAGGCATAATCACAAGAATCG 3 下劃 線為載體 同源 臂 和 ShARPC5 VR 5 CGTGAGCTC GGTACCGGATCCCAGCAAGACAACGCAGTATGC A 3 下劃線 為載體同 源臂 擴增 ShARPC5 基 因片段 重組 TRV2 ShARPC5 質粒 參照 LIU 等 18 的方法 將 TRV1 和 TRV2 ShARPC5 農 桿菌混合 菌液 注射到番 茄 LA1777 植 株 葉片 TRV2 ShPDS ShPDS 序列登錄 號 NM 001247166 作 為陽性 對照 接 種病 毒 30 d 觀 察 沉默 ShPDS 植株的光 漂白 癥狀 在葉片 上接種 On Lz 7 dpi days post inoculation 觀察 葉片侵 染表型 參照 SUN 等 19 的 方法在 7 14 dpi 統(tǒng)計 病害 嚴重度 計算 病情指數(shù) DI 病情指 數(shù) DI 某一病害嚴 重度的發(fā) 病植 物葉片數(shù) 病 害嚴重度 調查總植 株 葉片數(shù) 最高病級 100 利用 THORDAL CHRISTENSEN 等 20 的方法 對植物葉 片進 行 3 3 二氨 基聯(lián)苯胺 DAB 和臺 盼 藍染色 分別 于 6 18 24 48 72 hpi hours post inoculation 在 分 生孢子侵 染點 處檢測植 物產 生 HR 和 H 2 O 2 的形成率 形成率 HR 或 H 2 O 2 在侵 染點處形 成個 數(shù) 總侵染點 數(shù) 100 1 5 擬南芥過量表達 利用 ShARPC5 AF 5 GTCCATGGTACCCGGG GATCCATGGCTGAGATTGTCGAAGCA 3 下劃線 為載體同 源臂 和 ShARPC5 AR 5 ACGGGGGACT CTAGAGGATCCTCACACAGTATTCACAGTGTCA GCA 3 下劃 線為載體 同源 臂 擴增 ShARPC5 的 ORF 區(qū)段 重 組到 雙元載 體 pCAMBIA3301 的 BamHI 限制 酶 Promega 位點 由 CaMV35S 啟動子驅動 將 pCAMBIA3301 ShARPC5 轉化到農 桿 菌 GV3101 然 后通過浸 花法 將其導入 Col 0 野生 型擬南 芥中 21 轉 基因 T 1 代 植 株用含卡 那霉 素 25 g mL 1 的 0 5 MS 培養(yǎng)基 1 瓊 脂進行陽 性篩 選 催芽 2 周后 將 抗卡 6 8 中 國 農 業(yè) 科 學 5 3 卷 那霉素幼 苗移 栽到土壤 中 從自交 的 T 1 株系中獲 得卡 那霉素抗 性 的 T 2 代 植株 T 2 代植 株生 長 90 d 每個 處 理 3 4 株 然后 測定轉 基因株系 對 On Lz 的抗 性 同時 上述 T 2 代植株通 過使 用特異性 引物 LP CGGTT CTCCAAATGAAGACTT RP AATTGAGACTTTTC AAAGGTAATA PCR 檢 測確認為 轉基 因植株 為 了 量化病原 菌生 長狀況 在 7 dpi 統(tǒng)計 每個病 斑的分生 孢 子數(shù) 1 6 實時熒光定量PCR qRT PCR 分析 為了評估 在番 茄 MM 和 LA1777 上接 種病菌后 ARPC5 表達 量的變化 在 0 12 18 24 36 48 72 和 96 hpi 采樣 提 取 RNA 反 轉 為 cDNA 然 后 進 行 qRT PCR VIGS 試 驗 中 在 0 24 48 和 72 hpi 檢測沉默效率以及 PR1b1 PR1 和 Glucanase A PR2 Chitinase 3 PR3 表 達量 GAPDH 作為 內參基因 擬南芥轉基因植物在 0 24 48 72 hpi 取樣進 行 qRT PCR 以 UBQ10 為 內 參基因 表 1 使用 Biozol 總 RNA 提取 試劑盒提 取 總 RNA Qubit 2 0 Fluorometer 計算 RNA 濃度 使 用單鏈 cDNA 合成試劑 盒 和 oligo dT 18 引物將總 RNA 1 g 用 于 第一鏈 cDNA 合成 采用 IQ TM 5 real time PCR 系統(tǒng) 進 行 qRT PCR 擴增 在 qRT PCR 反應中 將 2 L 總 cDNA 添 加到含 有 10 L 2 SYBR 混合 液的 20 L PCR 反 應 液中 上 下 游 引物各 0 4 L 10 mol L 1 dH 2 O 7 2 L qRT PCR 反應條件 在 95 預 變性 10 min 隨后在 95 變 性 15 s 40 個周 期 55 退 火 30 s 72 延 伸 30 s 定 量 結果通 過 2 CT 法計算 試 驗 進行 3 次 生物 學重復 表1 qRT PCR 反應中的基因及引物 Table 1 Genes and primers in qRT PCR reaction 引物序列 Primer sequence 基因 Gene 正向引物 Forward primer sequence 5 3 反向引物 Reverse primer sequence 5 3 ShARPC5 SlARPC5 CGAAGGCATAATCACAAGA CAGCAAGACAACGCAGTA PR1b1 CATCCCGAGCACAAAAC TGAAGTCACCACCACCCT Glucanase A CTTTTACTTGTTGGGCTTCT ACTTCCTTTGAGGGCATT Chitinase 3 ACGCCATCCCCTAAAGA TGGACCCATCCCACATT GAPDH Control CTGGTGCTGACTTCGTTGTTG GCTCTGGCTTGTATTCATTCTCG AtARPC5 CGGAATGCTCAATGCTCT CGGTCCCCAGTAGAAAGTC UBQ10 Control AGAAGTTCAATGTTTCGTTTCATGTAA TTACGAATCCGAGGGAGCCATTG 1 7 數(shù)據(jù)分析 采用 SPSS 19 0 軟件對 數(shù)據(jù) 進行統(tǒng)計 分析 應用 Duncan 氏 新復極 差法進行差異 顯著性檢驗 P 0 05 表示兩組 處理 間差異顯 著 2 結果 2 1 番茄ARPC5鑒定和序列分析 利用擬南芥 ARPC5 作為探索基因 從番茄 LA1777 中克 隆到 767 個核 苷酸的基 因片 段 ShARPC5 Solyc01g090450 3 的開 放閱讀框 399 bp 編碼 132 個氨基酸 分 子量約 為 15 kD ShARPC5 與 AtARPC5 和 NtARPC5 具有高度 的序 列相似性 圖 1 其同 源 性分別為 86 36 和 97 73 SMART 和 RCSB PDB 程序分析顯示 ShARPC5 具有保守的 Pfam P16 Arc 結構域 氨基酸 2 131 其遺傳關系與 AtARPC5 和 NtARPC5 密切相關 ProtComp 9 0 程序預測 ShARPC5 蛋 白具有不 同的 細胞定位 包 括質膜 胞外 細胞質 線粒體 內質網(wǎng) 過氧化物酶體 高爾基體 和葉綠體 2 2 ARPC5 差異性誘導表達 為了確定 ARPC5 的 表 達量 用 qRT PCR 檢測番 茄與病原 菌互 作時 ARPC5 的 mRNA 表 達量 在 非親 和互作中 與 0 hpi 相比 ARPC5 在 18 36 hpi 顯著 上調表達 P 0 05 在 18 hpi 的表達 量達到峰 值 圖 2 為對照 的 6 倍 此 外 在親和互作中 ARPC5 表達量 在 18 hpi 顯著 高于對 照 0 hpi 12 hpi 以及 36 96 hpi 表 達量顯著 低于 對照 P 0 05 2 3 沉默 ShARPC5 對番茄抗病性的影響 為了確 定 ShARPC5 在病原 菌侵染番 茄中 的作用 利用煙草 脆裂 病毒 Tobacco rattle virus TRV 誘 導 沉默 ShARPC5 驗證基 因功 能 接種 TRV2 ShPDS 的 葉片在接 種 后 30 d 出現(xiàn) 光漂白的 表型 圖 3 A 證 1 期 馮嬋婧等 番茄 ShARPC5 抗白粉病功能分析 69 Nicotiana sylvestris XM 009773667 NsARPC4 Arabidopsis thaliana AT4G14147 AtARPC4 Saccharomyces cerevisiae NM 001179579 ScARC19 Arabidopsis thaliana AT2G33385 AtARPC2 Solanum habrochaites Solyc09g090550 ShARPC2 Nicotiana sylvestris XM 009791646 NsARPC2 Solanum habrochaites Solyc05g006470 ShARPC1 Arabidopsis thaliana AT2G30910 AtARPC1 Saccharomyces cerevisiae NM 001178582 ScARC40 Arabidopsis thaliana AT4G01710 AtARPC5 Solanum habrochaites Solyc01g090450 ShARPC5 Nicotiana sylvestris XM 009765961 NsARPC5 Saccharomyces cerevisiae NM 001182259 ScARC18 Saccharomyces cerevisiae NM 001179412 ScARC15 Saccharomyces cerevisiae NM 001183212 ScARC35 Solanum habrochaites Solyc07g007630 ShARPC3 Nicotiana tomentosiformis XM 009610279 NtARPC3 Arabidopsis thaliana AT1G60430 AtARPC3 Arabidopsis thaliana AT3G27000 AtARP2 Saccharomyces cerevisiae NM 001180088 ScARP2 Saccharomyces cerevisiae NM 001181723 ScARP3 78 83 100 79 100 99 100 45 100 88 98 44 73 96 71 55 25 24 26 0 2 Solanum habrochaites Solyc12g098430 ShARPC4 B 66 66 66 66 66 66 66 66 131 131 131 131 131 131 131 131 ShARPCS AtARPCS StARPCS NtARPCS CaARPCS DhARPCS CaARPCS SiARPCS ShARPCS AtARPCS StARPCS NtARPCS CaARPCS DhARPCS CaARPCS SiARPCS Consensus Consensus Pfam P16 Arc domain amino acids 2 131 A A ShARPC5 的多重氨基酸序列比對以及氨基酸序列的特征 氨基酸序列中黑色部分表示同源性達到 100 粉色表示同源性 75 青色表示同源 性 50 Multiple protein sequence alignment of ShARPC5 and characterized members of ARPC5 proteins Black boxes indicate regions of 100 homology pink boxes indicate 75 homology level and cyan boxes highlight 50 homology level B ShARPC5 系統(tǒng)進 化分析 在不同的基因名稱后顯示各基 因登錄號 Evolutionary analysis of ShARPC5 Accession numbers are shown after the gene names 圖1 番茄ARP2 3復合體亞基ShARPC5的序列分析 Fig 1 Sequence analysis of tomato actin related protein 2 and 3 ARP2 3 complex subunit 5 ShARPC5 0 1 2 3 4 5 6 7 01 21 82 43 64 87 29 6 時間 Time hpi 相對表 達量 Relative expression 親和 互作Compatible interaction 非親 和互作Incompatible interaction 圖2 qRT PCR 分析番茄葉片ARPC5表達量 Fig 2 ARPC5 expression in tomato leaves analyzed by qRT PCR 7 0 中 國 農 業(yè) 科 學 5 3 卷 TRV2 ShPDS TRV2 ShARPC5 CK A 0 2 4 6 8 10 12 14 16 71 4 時間 Time dpi 病 情指數(shù) Disease index CK TRV2 ShARPC5 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 1 4 CK ShARPC5 PR1b1 Glucanase A Chitinase 3 相對 表達量 Relative expression 1 0 BC A 不同處理 對照株 沉默 ShPDS 植株 沉默 ShARPC5 植株 接種 白粉菌 7 d 后的表型觀察 Infection phenotypes of CK TRV2 TRV2 ShPDS TRV2 ShARPC5 tomato leaves at 7 dpi B 對照株和沉默 ShARPC5 植株在接種白粉菌后 7 和 14 d 的病情指 數(shù) Disease indexes of CK and TRV2 ShARPC5 plants at 7 and 14 dpi respectively C 對照株和沉默株接種白粉菌后 24 h ShARPC5 和 PRs 基 因表達量變化 Relative mRNA transcript levels of ShARPC5 and PRs at 24 hpi determined by qRT PCR 圖3 在番茄上沉默ShARPC5 對On Lz菌株侵染能力的影響 Fig 3 Effect of silencing of ShARPC5 in tomato LA1777 plants on the infection ability of On Lz strain 實 TRV VIGS 沉默系統(tǒng)的穩(wěn)定性 與對照相比 沉 默 ShARPC5 植株顯示出明顯的白粉病病斑 沉默株 的病情指數(shù)更高 在 7 和 14 dpi 分別達到 6 0 和 13 1 圖 3 B 在 24 hpi ShARPC5 的沉默效率達到 78 圖 3 C 且沉默株中 PR1b1 顯著下調表達 P 0 05 2 4 沉默 ShARPC5 對番茄防衛(wèi)反應的影響 通過顯微觀察病原菌侵染番茄葉片后植物上產生 的 HR 和 H 2 O 2 變化進一步 研究 ShARPC5 如何 參與番 茄抗病性 在 48 和72 hpi 沉默 ShARPC5 的植 株上 HR 形成率顯著低于對照 分別為 26 和 36 圖 4 A 在 72 hpi 沉默株 上的 H 2 O 2 形 成率顯著 低于 對照 P 0 05 僅為 34 圖 4 B 2 5 煙草瞬時表達ShARPC5 分析 為了進一 步檢 測 ShARPC5 的功能 基 于 PVX 瞬 時植物表 達系 統(tǒng) 使 用本氏 煙 Nicotiana benthamiana 評估 ShARPC5 是否誘導植物細胞壞死 用表達 PGR106 GFP 的農桿菌 侵染 煙草葉片 不能 誘導產生 細 胞壞死 但是 用轉 PGR106 ShARPC5 的 農桿菌侵 染煙 草葉片產生明顯的細胞壞死 圖 5 同 樣 用表達 PGR106 BAX 的農桿菌 侵染 葉片也能 產生 壞死 2 6 過表達 ShARPC5 對擬南芥抗病性的影響 為了檢 測 ARPC5 在擬南芥上的抗病性 分別在野 生型 Col 0 擬南芥和野生型 Col 0 轉化 pCAMBIA3301 ShARPC5 植 株上接 種 On Lz 過表 達 over expression OE ShARPC5 擬南芥植株抗病性增強 植株葉片上 幾乎未發(fā) 現(xiàn)白 粉病病斑 圖 6 A 顯 微觀察發(fā) 現(xiàn) 與對照相比 在野生型 Col 0 轉化 pCAMBIA3301 ShARPC5 植株上單個病斑分生孢子數(shù)顯著減少 圖 6 B P 0 05 3 討論 通過核苷 酸和 氨基酸序 列比 對 表明番 茄 ARPC5 與擬